一种便捷观察兰科植物菌根显微结构的方法
【专利摘要】一种便捷观察兰科植物菌根显微结构的方法，包括一个准备根段材料、固定液、解离液以及染色液的步骤，一个对根段进行固定的步骤，将兰科植物根段完全浸没在固定液中，一个对根段进行切片的步骤，将根段切成薄片移入盛有清水的容器中备用，一个对根部材料进行解离的步骤，将根部材料浸没在KOH溶液中解离，一个对根部材料进行染色的步骤，将解离好的根部材料放入锥虫蓝溶液中染色，一个对根部材料进行压片、封片的步骤，然后放在光学显微镜下进行镜检。本发明可以清晰观察到视野中细胞内是否被菌根真菌侵染，通过统计视野内被侵染的细胞展视野内总细胞的比例，检测兰根是否被侵染以及被侵染的程度，为研究兰花共生生长提供基础数据。
【专利说明】一种便捷观察兰科植物菌根显微结构的方法
【技术领域】
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[0001]本发明涉及农业领域，尤其涉及一种兰科植物菌根，具体来说是一种便捷观察兰科植物菌根显微结构的方法。
【背景技术】
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[0002]兰科植物高雅幽香，是一类具有极高观赏价值和经济价值的珍贵花卉和药用植物，随着花卉产业和天然药物产业的快速发展，对兰科植物资源的需求越来越大，但许多兰科植物繁殖能力弱，生长缓慢(陈瑞蕊，林先贵，施亚琴，“兰科菌根的研究进展”，《应用于环境生物学报》，2003，9 (I):97?101)。
[0003]目前兰花的繁殖多采用组培的方法，但移栽无菌苗生长缓慢，长势明显劣于原生地生长的植株，其原因在于无菌苗没有形成有效的菌根结构(高薇薇，郭顺星，“三种内生真菌对铁皮石斛、金线莲生长影响的研究”，《中草药》，2002，33 (6):543 ;颜容，“独花兰菌根真菌的研究”，北京:北京林业大学，2005)。许多兰花具有肥厚的肉质根，只有很少的侧根和根毛，影响营养成分的吸收需要与菌根真菌共生才能生长良好(伍建榕，韩素芬，朱有勇等，“云南兰科植物菌根内生真菌种类研究”，《西南林学院学报》，2006，26 (3):5?10.)，研究表明菌根真菌的菌丝扩大了兰花植物的根际范围，增强兰花根对营养成分的吸收和利用(Smith SE, “Carbohydrate translocat1n in orchid mycorrhizas，，，《New Phytol》，1966,65:488-499 ;赵杨景，郭顺星，高薇薇等，“三种内生真菌与大花蕙兰共生对矿质营养吸收的影响”，《园艺学报》，1999，26 (2):110-115)。采集并分离兰花植物根部的真菌，通过接种在无菌兰苗上，检测接种后兰苗的株高、重量等生长指标，结合根部细胞侵染情况的观察，筛选优良的菌根真菌用于兰花的扩繁和栽培，这是研究兰花繁殖和保育的重要研究方向。由于兰根粗大，表面具有多层死细胞形成的根被，维管柱坚韧，常规的染色方法周期长和不易操作等特点并不十分适合兰苗侵染率的观察。
【发明内容】
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[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种便捷观察兰科植物菌根显微结构的方法，所述的这种方法要解决现有技术中的的兰科植物菌根显微结构观察方法中出现的复杂繁琐、耗费时间较长或观察效果不佳等问题。
[0005]本发明一种便捷观察兰科植物菌根显微结构的方法，包括以下步骤:
[0006]I) 一个准备根段材料、固定液、解离液以及染色液的步骤，所述的根段材料为新鲜的兰科植物根段，在所述的兰科根段中，根段长度在I?1cm之间，所述的固定液是FAA固定液，所述的解离液是质量百分比浓度为5%?10%的碱溶液，所述的染色液为锥虫兰溶液；
[0007]2) 一个对根段进行固定的步骤，将兰科植物根段完全浸没在FAA固定液中，至少固定24h ;优选的固定时间为24?48小时。
[0008]3) 一个对根段进行切片的步骤，将根段切成复数个薄片，所述的薄片的厚度在0.1?Icm之间，将根段切片移入盛有清水的容器中备用；
[0009]4) 一个对根段切片进行解离的步骤，将根段切片放入解离液中解离，解离时间为5?60min，解离温度为80?95°C，
[0010]5) 一个对根段切片进行染色的步骤，解离后，将解离好的根段切片在去离子水中冲洗2?3次后，再放入锥虫蓝溶液中染色，染色的时间为6?24h ;
[0011]6) 一个对根段切片进行压片、封片的步骤，将染色好的根段切片平放在载玻片上，滴上甘油，盖上盖玻片，用滤纸轻压后，放在光学显微镜下进行镜检。
[0012]进一步的，所述解离液为质量百分比浓度为10%的KOH溶液。
[0013]进一步的，所述的FAA固定液由质量百分比浓度为50%或70%的酒精、冰醋酸和福尔马林组成，酒精、冰醋酸和福尔马林的体积比为90:5: 5。
[0014]进一步的，所述的福尔马林为质量百分比浓度为37%?40%的甲醛溶液。
[0015]进一步的，所述的解离时间为30min。
[0016]进一步的，所述的锥虫蓝溶液的质量百分比浓度为2%，所述的染色时间为12h。
[0017]本发明的解离液中，KOH的质量百分比浓度控制为10%，解离时间控制在30min，浓度高会过度解离，浓度低解离不充分，解离时间长短均会影响显微结构的观察。
[0018]本发明的染色液中，锥虫兰溶液的质量百分比浓度为2%，染色时间控制在12h，染色时间长导致细胞着色较深，染色时间段导致菌丝结构染色不充分，影响观察效果。
[0019]本发明的方法和已有技术相比较，操作便捷快速、结果可靠。采用本发明的方法可以检测兰科植物根部的侵染情况，是否侵染成功形成菌根结构以及菌根的侵染频率，可以筛选能与兰花幼苗高效共生的优良菌株从而用于促进兰花植物的生长。
[0020]本发明涉及的兰花菌根真菌(LH53),属于散囊菌纲(Eurot1mycetes)、散囊菌目(Onygenales)、畸枝霉属(Malbranchea),其分类命名为Malbranchea sp.,该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号(中科院微生物研究所)，保藏日期为2014年5月13日，保藏号为CGMCC No:9222。
[0021 ] 本发明的兰花菌根真菌(LH94),属于伞菌纲(Agaricomycetes),鸡油菌目(Cantharellales),胶膜菌科(Tulasnellaceae)，胶膜菌属(Tulasnella),分类命名为Tulasnella sp.。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号(中科院微生物研究所)，保藏日期为2014年6月9日，保藏号为CGMCC No:9247。
[0022]本发明和与已有技术相对照，其效果是积极和明显的。本发明的方法可以快速观察兰花共生菌根的显微结构，操作过程简单方便、观察效果佳，可以清晰观察到视野中细胞内是否被菌根真菌侵染，通过统计视野内被侵染的细胞展视野内总细胞的比例(即侵染率)，检测兰根是否被侵染以及被侵染的程度，为研究兰花共生生长提供基础数据。
【专利附图】
【附图说明】
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[0023]图1是本发明的一种接种菌株LH53的兰花幼苗根部横切面在光学显微镜100倍下显微结构照片。
[0024]图2是不接种的兰花幼苗根部横切面在光学显微镜100倍下显微结构照片。【具体实施方式】:
[0025]实施例1兰花菌根真菌的分离与鉴定:
[0026]一、分离根系材料:采取上海市农业科学院盆栽春兰搬至遮荫大棚处待用。
[0027]二、分离与鉴定培养基:
[0028]使用麦芽提取物培养基(MEA)，配方为:麦芽提取物20g、胰蛋白胨I克、葡萄糖20克、琼脂20克，蒸馏水定容至1000毫升，然后121 °C高压灭菌20分钟，冷却至60°C以下时加入0.03克链霉素。
[0029]三、分离与形态鉴定方法:
[0030]菌根真菌菌株的分离:取新鲜健康的兰花植物数段根部，放在自来水下冲洗，直至根部表面无污泥。将根部切成几段长约为1cm的小段，用无菌水清洗3次，滤纸吸干水分后浸入75%的酒精60s，接着浸入2%次氯酸钠60s，然后再浸入75%的酒精30s，最后用无菌水清洗3-5遍。将消毒完成的根部材料在无菌条件下切成0.5cm小段，在无菌条件下分别将其接种至灭菌后冷却至室温的MEA培养基(含lOOug/ml青霉素)，于26°C培养箱中黑暗培养3 — 25d。
[0031]菌落形态和菌丝体显微特征观察鉴定:待菌落从根段中长出来，用接种针挑取菌落至MEA培养基,继续进行菌落形态鉴定,培养7-15d后观察菌落形态的一致性和均匀性，若菌落形态有差异，进行二次分离和鉴定。菌落形态特征稳定的菌株用接种针挑取至MEA平板22°C培养箱中黑暗培养7-15d。本实施例所使用培养箱为赛福恒温恒湿培养箱HWS —350。
[0032]四、分子鉴定方法:
[0033]菌丝的收集:在无菌条件下挑取试管平面上保存的菌株菌丝至灭菌冷却后的MEA培养基上活化，在黑暗条件下培养3?7d，刮取菌丝，使用CTAB法提取总DNA。
[0034]ITS区段的PCR扩增:rDNA ITS区段的扩增采用通用引物ITSl (5' TCC GTA GGTGAA CCT GCG G 3' )，ITS4(5/ TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3' )。PCR 反应体系的组成为 1XBuffer 2.5 μ l,50mmol/L Mg2+ 3 μ 1,10mmol/L dNTP 0.5 μ 1，10 μ mol/L 引物各
0.5 μ 1，模板DNA I μ I (终浓度在50ng/l左右)，Taq酶IU (0.2 μ I)，用无菌纯水定容至25 μ L.PCR反应采用B1RAD DNA Engine型PCR仪，循环参数为:预变性95°C，5min，变性95°C，30s，退火53°C，30s,延伸72°C，45s ;终末延伸72°C，5min。共进行35个循环。
[0035]产物纯化及测序:PCR产物经试剂盒纯化后使用载体是PMD18?T转化连接，测序引物为M13R(?48)，使用测序仪器ΑΒΙ3730Π进行测序(测序工作由上海英骏生物技术有限公司完成)。所得序列使用PRMER3软件进行网上比对，并辅以人工校对，确定序列的可靠性。得到的序列在NCBI上BLAST，使用数据库为GenBank。
[0036]五、菌株鉴定结果:
[0037]本发明发现了两种真菌菌株，其中一种LH53菌株形态特征为:菌落米白色，生长之初呈绒毡状，一段时间后呈棉絮状。
[0038]六、分子鉴定结果:
[0039]LH53真菌核糖体脱氧核糖核酸内转录间隔区的序列如SEQ ID N0:1所示，ITS序列经BLAST比对，与Malbranchea cinnamomea的ITS序列相似度为96 经ITS序列比对最相近物种为散囊菌纲(Eurot1mycetes)、散囊菌目(Onygenales)、畸枝霉属(Malbranchea)的真菌，保藏号为CGMCC No: 9222，鉴定为新的兰花菌根真菌菌株。
[0040]七、菌株鉴定结果:
[0041]七、其中一种LH94菌株形态特征为:菌落米白色绒毡状，呈圆形。
[0042]八、分子鉴定结果:
[0043]LH94真菌核糖体脱氧核糖核酸内转录间隔区的序列如SEQ ID N0:2所示。LH94ITS序列经BLAST比对，与菌株Tulasnella calospora的ITS序列相似度85 经ITS序列比对最相近物种为胶膜菌属(Tulasnella),胶膜菌科(Tulasnellaceae),鸡油菌目(Cantharellales)，伞菌纲(Agaricomycetes)，分类命名为 Tulasnella sp.，保藏号为CGMCC No:9247，鉴定为新的兰花菌根真菌菌株。
[0044]实施例2适宜染色方法的筛选
[0045]将兰花组培苗取出，用刀片切下3?6cm长的根，用去离子水冲洗干净、吸干水分后置于FAA固定液中固定24h以上。准备含有去离子水的培养皿，将固定好的根制作徒手切片，切片的厚度小于1cm，挑选较薄且厚度均匀的切片放入收集管中，浸没在10% KOH溶液中，选择10% KOH解离液解离不同的时间梯度,具体为5min、10min、30min和60min。接着分别置于90°C水浴锅中水浴1min后，倒去水解液，添加2%的锥虫蓝染色液，分别置于室温浸没不同的时间梯度，具体是6h、12h和24h后，将实验材料放入载玻片中，滴上一滴甘油，45度角盖上盖玻片，去除气泡，在光学显微镜下观察横切面细胞结构，检测观察效果(见表I)。本实施例所使用光学显微镜为莱卡光学显微镜Leica DM2000。结果表明在浓度为10% KOH解离时间30min、染色时间12h效果最佳，细胞较为均匀分散、菌丝着色明显。
[0046]表I不同染色方法对染色效果的影响
[0047]
~10%KOH解离时间 ^2%锥虫兰染色时间^染色效果
I5 min6h细胞解离不允分、菌丝着色浅丁I2h细胞解离不充分了24h细胞、菌丝着色过深
4i O min6 h细胞不够分散、菌丝着色浅了12h细胞不够分散
~6~24h细胞不够分散、着色过深
—?30min6h细胞较为分散、菌丝着色不够明显了12h细胞较为均匀分散、菌丝着色明显
~9~24h细胞较为分散、着色较深
[0048]1060 min6h细胞过于分散、菌丝着色不明显
1Γ12h细胞过于分散
24h细胞过于分散且着色过深
[0049]实施例3
[0050]一、兰花组培苗材料:采集兰花“红美人”的组培苗，选择的组培苗基本一致，鲜重约为0.6g,株高约为8cm。
[0051]二、栽培基质:选择充分灭菌后晾干的草炭:黄沙以一定比例混合作为栽培基质，具体配方为草炭:黄沙1:2，浇入MMN液体培养基，500mL/1500g栽培基质，混合均匀后分装至640mL栽培平内，高压灭菌后冷却至常温。
[0052]三、接种方法:在无菌条件下每瓶移栽3株兰花苗，每个处理接种6瓶兰花苗作为重复，置于组培室无菌培养。待生长一周后，检查有无污染，在无污染的组培瓶内分别接种供试菌株，即在每个组培瓶的基质中央放置一直径为0.5cm的菌饼，约在栽培基质下Icm靠近苗的根部，继续在培养室培养，培养室条件为温度22?26°C，光照周期16?10h/8?14h，光强度为2000?40001uX，培养80d后，统计幼苗生长量和侵染情况，接种菌株后幼苗平均侵染率、鲜重增长率、株高增长率和干鲜比均高于其他处理组和对照处理组(表2)。结果表明:本发明方法能准确观察兰花菌根结构，检测菌根的侵染情况，接种的菌株对兰花幼苗的生长具有抑制或促进的作用，其中接种菌株LH127对兰花幼苗的生长影响不利，而接种菌株LH53 (保藏号为CGMCC No:9222)和LH94对兰花幼苗的生长具有一定程度上的促进作用。
[0053]表2不同接种处理组培养80d后兰苗生长情况统计表
[0054]
接种菌株 I平均侵染率(％ ) I鲜重增长率(％) I株高增长率(％) I干鲜比(％ )
LH12733.742.0612.288.53
LH5371.392.0432.5710.80
LH9474.34100.9730.409.85
CKO61.0427.318.30
[0055]实施例4
[0056]一、兰花组培苗材料:采集兰花“红美人”的组培苗，选择的组培苗基本一致，鲜重约为0.9g,株高约为1cm0
[0057]二、栽培基质及处理方法同实施案例3，培养80d后，统计幼苗生长量和侵染情况，接种菌株后幼苗平均侵染率、鲜重增长率、株高增长率和干鲜比均高于其他处理组和对照处理组(表4).结果表明:本发明方法能准确观察兰花菌根结构，检测菌根的侵染情况，接种的菌株对兰花幼苗的生长具有抑制或促进的作用，其中接种菌株LH127对兰花幼苗的生长影响不利，而接种菌株LH53 (保藏号为CGMCC No:9222)和LH94对兰花幼苗的生长具有一定程度上的促进作用。
[0058]表3不同接种处理组培养80d后兰苗生长情况统计表
[0059]
接种菌株I平均侵染率(％ )I鲜重增长率(％) I株高增长率(％ ) I干鲜比(％ )
LH12713.2556.0816.85Σ?Ε
LH5366.4862.5030.208?46
LH9473.0689.7622.918?26
CKO47.0622.458703
[0060]实施例5
[0061]一、兰花组培苗材料为兰花“红美人”的组培苗，选择的组培苗基本一致，鲜重约为0.9g,株高约为1cm0
[0062]二、共生培养基:葡萄糖10克、胰蛋白胨5克、磷酸氢二钾I克、硫酸镁0.5克、孟加拉红0.033克，琼脂20克，蒸馏水定容至1000毫升，调节PH值至5.0，然后121°C高压灭菌20分钟，冷却至60°C以下时倒平板待用。
[0063]三、接种方法:在无菌条件下每瓶移栽3株兰花苗，每个处理接种6瓶兰花苗作为重复，置于组培室无菌培养。待生长一周后，检查有无污染，在无污染的组培瓶内分别接种供试菌株，即在每个组培瓶的基质中央放置一直径为0.5cm的菌饼,约在栽培培养基下Icm靠近苗的根部，继续在培养室培养，培养室条件为温度22?26°C，光照周期16?10h/8?14h，光强度为2000?40001uX，培养80d后，统计幼苗生长量和侵染情况，接种菌株后幼苗平均侵染率、鲜重增长率、株高增长率和干鲜比均高于其他处理组和对照处理组(表4)。结果表明:本发明方法能准确观察兰花菌根结构，检测菌根的侵染情况，接种的菌株对兰花幼苗的生长具有抑制或促进的作用，其中接种菌株LH127对兰花幼苗的生长影响不利，而接种菌株LH53(保藏号为CGMCC No:9222)和LH94对兰花幼苗的生长具有一定程度上的促进作用。(如图1、图2所示)
[0064]表4不同接种处理组培养80d后兰苗生长情况统计表
[0065]
接种菌株I平均侵染率(％ ) I鲜重增长率(％ ) I株高增长率(％ ) I干鲜比(％ )
LH127^8117.4414.599Λ3
LH5332.1149.4515.378?36
LH9439.2941.0414.0010.05
CKO29.7611.83δΓο?
[0066]实施例6
[0067]一、兰花组培苗材料:采集兰花“红美人”的组培苗，选择的组培苗基本一致，鲜重约为0.9g,株高约为10cm。
[0068]二、栽培基质及处理方法同实施案例3，接种菌株为LH53(保藏号为CGMCCNo: 9222)，培养80d后，统计幼苗生长量和侵染情况，分别用本发明方法与常规的石蜡切片法检测兰花根部菌根的显微结构，结果如下(表4)。实验过程中我们尝试石蜡切片染色方法多次仍失败，但本方法却清晰观察地兰花幼苗的菌根结构。研究表明由于兰根粗大，表面具有多层死细胞形成的根被，维管柱坚韧，常规的染色方法周期长和不易操作等特点并不十分适合兰苗侵染率的观察。本发明方法较常规的石蜡切片法步骤简单方便、耗费时间较短，且更环保，副作用较少，易于初学者掌握和运用。
[0069]表5兰科植物菌根显微结构的不同染色方法比较
[0070]
【权利要求】
1.一种便捷观察兰科植物菌根显微结构的方法，其特征在于包含下列步骤: 1)一个准备根段材料、固定液、解离液以及染色液的步骤，所述的根段材料为新鲜的兰科植物根段，在所述的兰科植物根段中，根段长度在I?1cm之间，所述的固定液是FAA固定液，所述的解离液是质量百分比浓度为5%?10%的碱溶液，所述的染色液为锥虫兰溶液； 2)一个对根段进行固定的步骤，将兰科植物根段完全浸没在FAA固定液中，至少固定24h ； 3)—个对根段进行切片的步骤，将根段切成复数个薄片，所述的薄片的厚度在0.ricm之间，将根段切片移入盛有清水的容器中备用； 4)一个对根段切片进行解离的步骤，将根段切片放入解离液中解离，解离时间为5?60min，解离温度为80?95°C ； 5)—个对根段切片进行染色的步骤，解离后，将解离好的根段切片在去离子水中冲洗2?3次后，再放入锥虫蓝溶液中染色，染色的时间为6?24h ; 6)—个对根段切片进行压片、封片的步骤，将染色好的根段切片平放在载玻片上，滴上甘油，盖上盖玻片，用滤纸轻压后，放在光学显微镜下进行镜检。
2.根据权利要求1所述的便捷观察兰科植物菌根显微结构的方法，其特征在于:所述解离液为质量百分比浓度为10%的KOH溶液。
3.根据权利要求1所述的便捷观察兰科植物菌根显微结构的方法，其特征在于:所述的FAA固定液由质量百分比浓度为50%或70%的酒精、冰醋酸和福尔马林组成，酒精、冰醋酸和福尔马林的体积比为90:5:5。
4.根据权利要求3所述的便捷观察兰科植物菌根显微结构的方法，其特征在于:所述的福尔马林为质量百分比浓度为379Γ40%的甲醛溶液。
5.根据权利要求1所述的便捷观察兰科植物菌根显微结构的方法，其特征在于:所述的解离时间为30min。
6.根据权利要求1所述的便捷观察兰科植物菌根显微结构的方法，其特征在于:所述的锥虫蓝溶液的质量百分比浓度为2%，所述的染色时间为12h。
【文档编号】G01N1/28GK104132940SQ201410356184
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年7月24日 优先权日:2014年6月30日
【发明者】黄芳, 张春英, 王强, 尹丽娟, 高建红, 张 杰 申请人:上海市园林科学研究所