保留组织纹理结构使完整器官透明的方法及相应混合液的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种保留组织纹理结构、使完整器官透明的方法及相应混合液，其核心是配制一种包含糖类、离液剂和抗氧化剂的混合液/混合液组合。本发明所用混合液/混合液组合是粘度较低、无刺激性挥发气味的透明液体，利用该溶液透明完整器官的方法操作简便、透明速度快、透明效果好，透明过程中无需特殊防护，透明后器官形态大小不变，器官基本维持天然本色，器官内部天然纹理结构保留，并与其他常用荧光标记技术兼容，且本发明的方法作用力强，可使体型较大成年哺乳动物的器官透明。
【专利说明】保留组织纹理结构使完整器官透明的方法及相应混合液
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学和透明标本制备领域，更具体地，涉及一种保留组织纹理结构、使完整器官透明的方法及相应混合液。
【背景技术】
[0002]全面准确地了解器官的内部结构及其神经血管走向情况是神经科学乃至整个生物医学研究领域不可或缺的基础，但组织不透明阻碍了对于大多数器官的全局式观察。
[0003]组织透明技术(特别是整脑透明技术)使得器官不必切片，即可在完整状态下进行观察研究。现有组织透明技术包括美国专利US6472216中以及Chiang，A.S.等人提出的FocusClear 技术(参见 Chiang, A.S., et al.“Insect NMDA receptors mediate juvenilehormone b1synthesis，，，Proc Natl Acad Sc1.U S A 99,37-42 (2002))、Dodt, H.U.等人提出的 BABB 技术(参见 Dodt, H.U., et al.“Ultramicroscopy:three-dimens1nalvisualizat1n of neuronal networks in the whole mouse brain”，Nat.Methods4,331-336(2007))、PCT 专利 W02011111876A1、中国专利 CN102859344A 中以及 Hama，H.等人提出的 Scale 技术(参见 Hama, H., et al.“Scale:a chemical approach forfluorescence imaging and reconstruct1n of transparent mouse brain”， Natureneuroscience 14,1481-1488 (2011)) > Erturk, A.等人提出的 3DISC0 技术(参见 Erturk,A., et al.“Three-dimens1nal imaging of solvent-cleared organs using 3DISC0”，Nature protocols 7,1983-1995 (2012)), Ke, Μ.T.等人提出的 SeeDB 技术(参见 Ke，Μ.Τ., Fujimoto, S.&Imai, Τ.“SeeDB:a simple and morphology-preserving opticalclearing agent for neuronal circuit reconstruct1n，，， Nature neuroscience 16,1154-1161 (2013)) ,PCT 专利 W02014025392A1 中以及 Chung, K.等人提出的 CLARITY (参见Chung, K., et al.“Structural and molecular interrogat1n of intact b1logicalsystems”, Nature 497,332-337(2013))。
[0004]其中，FocusClear技术使用二甲基亚砜、泛影酸、泛影葡胺等成分，成本高昂，并且导致生物样品严重皱缩，适用于处理昆虫标本，无法使成年哺乳动物器官透明。
[0005]BABB技术和3DISC0技术均使用有机溶剂，处理后组织透明效果很好，但是处理后的组织严重皱缩，并且容易导致组织中荧光标记信号淬灭。此外，这些有机溶剂带有强烈刺激性气味，操作过程中常令操作者产生头疼、恶心等不适。
[0006]Scale技术利用恒定浓度(4M或更高)的尿素和少量表面活性剂(如TritonX-100)组成的混合液持续浸泡器官。该方法透明需要时间较长，即便是对于新生小鼠整脑也至少三周以上。此外，Scale技术引起组织严重膨胀。
[0007]SeeDB技术使用浓度不断增加的梯度果糖溶液浸泡组织,最后一步必须使用饱和浓度的果糖(质量体积分数为130% )，在透明速度和透明效果方面均优于单纯使用尿素的方法。SeeDB技术组织形态保持良好，并与组织内荧光标记兼容良好，但往往导致组织变为棕褐色(即棕色变)。另外，115%以上浓度的果糖溶液非常粘稠，无论是更换溶液还是在溶液中操作组织样品，均非常困难。特别是质量体积分数为130%的果糖溶液必须在37度下才具有微弱流动性，若温度降低，该溶液即很快凝固或者造成果糖再度析出，从而影响组织透明或者妨碍观察。
[0008]CLARITY技术利用电泳法去除组织中引起散射的脂类物质得以实现透明。该方法组织透明效果很好。不过，采用该方法透明组织需要使用特殊的水凝胶预先固定组织，并使用一套特殊的电泳装置方可实现，且水凝胶储存与灌注过程均需低温条件，整个操作过程严格、繁琐，最优实验条件范围很窄，难以推广使用。此外，该方法因为溶脂造成细胞膜被破坏、组织天然纹理结构消失。
【发明内容】
[0009]为克服上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种兼具保留器官内部天然纹理结构、保存荧光标记信号的快速简便的完整器官透明方法及相应混合液。
[0010]为了实现上述目的，作为本发明的一个方面，本发明提供了一种保留组织纹理结构、使完整器官透明的混合液，包含糖类、离液剂和抗氧化剂。
[0011]其中,所述糖类选自单糖和二糖中的至少一种。
[0012]其中，所述单糖为果糖。
[0013]其中，所述二糖为蔗糖。
[0014]其中，所述离液剂选自盐酸胍、氯化锂、尿素、硫脲中的至少一种。
[0015]其中，所述抗氧化剂选自巯基乙醇、3-巯基-1，2-丙二醇、硫辛酸中的至少一种。
[0016]其中，所述糖类的质量体积分数为10?100%。
[0017]其中，所述离液剂的质量体积分数为5?50%。
[0018]其中，所述抗氧化剂的质量体积分数为0.5?5%。
[0019]作为本发明的另一个方面，本发明还提供了一种保留组织纹理结构、使完整器官透明的混合液组合，所述梯度混合液组合包括N种如上任一项所述的混合液，其中所述N种混合液的糖类浓度逐渐增加，离液剂浓度逐渐降低，N为2-20之间的正整数。
[0020]其中，N为 5_10。
[0021]其中，当N = 5时，所述N种混合液的糖类的质量体积分数分别为10-40%、40-60 %、60-80 %、80-90 %、100 %。
[0022]其中，当N = 5时，所述N种混合液的糖类的质量体积分数分别为10-35%、35-40 %、40-60 %、60-90 %U00%o
[0023]作为本发明的再一个方面，本发明还提供了一种保留组织纹理结构、使完整器官透明的方法，包括下列步骤:使用如上任一项所述的混合液组合依次处理固定后的完整器官标本，实现透明；其中，体型较小动物的器官可依次在所述混合液组合的各种混合液中持续浸泡，体型较大动物的器官可依次经血管灌注所述混合液组合的各种混合液。
[0024]其中，先使用糖类浓度最小的混合液处理所述完整器官标本，再依次逐步使用浓度更大一级的混合液处理所述完整器官标本。
[0025]其中，对于浓度为10-40%的混合液需处理I?12小时，对于浓度为60_80%的混合液需处理I?4小时，浓度为100%的混合液需处理I?12小时。
[0026]其中，在使用所述混合液组合的各种混合液处理完所述完整器官标本之后，再使用糖类浓度为100%的混合液浸泡12-24小时。
[0027]通过上述技术方案可知，本发明整个操作过程简单，不需要特殊实验装置；所用混合液无刺激性气味挥发，不需要特殊防护，且透明效果确定、透明速度较快，不会引起组织严重变形、变色；本发明方法既能与常用荧光标记技术兼容，又能保留器官内部的天然纹理结构；此外，不仅可使体型较小成年哺乳动物的器官透明，也可使体型较大成年哺乳动物的器官透明。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1是本发明100%浓度的混合液溶液流动性测试的液面移动对比示意图；
[0029]图2是成年小鼠半脑标本经本发明实施例3的梯度混合液组合浸泡前后的对比照片;
[0030]图3是分光光度计检测的成年小鼠半脑标本经本发明实施例3的梯度混合液组合浸泡前后的透光率对比曲线图；
[0031]图4是成年小鼠整脑标本在透明前、SeeDB方法处理后及本发明实施例3方法处理后的颜色对比照片；
[0032]图5是成年小鼠半脑标本经本发明实施例3的梯度混合液组合浸泡前后的形态对比照片；
[0033]图6是荧光蛋白转基因小鼠脑标本经本发明实施例3的梯度混合液组合浸泡后的双光子显微镜图像；
[0034]图7是成年小鼠整脑标本在透明前及本发明实施例3方法处理后的高场强磁共振扫描图像；
[0035]图8是成年兔脑标本在动脉灌注本发明实施例3的梯度混合液组合前后的对比照片。
【具体实施方式】
[0036]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
[0037]首先需要明确的是，质量体积分数，又叫“质量体积比浓度”或简称“质量体积比”，是指溶液中溶质的质量与溶液的体积之比，例如质量体积分数为10%的果糖溶液，即为100克果糖溶解于水中形成I升的果糖溶液，100克/升=0.1千克/升，消去单位换算成百分比简写为10%。
[0038]本发明提供了一种保留组织纹理结构、使完整器官透明的混合液，包含糖类、离液剂和抗氧化剂。糖类具有较高的折射率，用其处理组织，可以较好的匹配动物组织的折射率，使组织更透明；离液剂打破氢键，使蛋白质发生可逆性变性，它的加入增加样品中膜蛋白的溶解性；抗氧化剂可以很好的阻止溶液变色以致变质。其中，糖类选自单糖(如果糖)和二糖(如蔗糖)的至少一种，糖类的质量体积分数为10?100%。离液剂选自尿素、硫脲、盐酸胍、氯化锂等的至少一种，离液剂的质量体积分数为5?50%。抗氧化剂可为选自3-巯基-1，2-丙二醇、巯基乙醇、硫辛酸等的至少一种，抗氧化剂的质量体积分数为0.5?5%。
[0039]优选地，本发明的混合液包含质量体积分数为10?100%的糖类，例如果糖，质量体积分数为5?50%的离液剂，例如尿素，以及质量体积分数为0.5?5%的抗氧化剂，例如3_疏基_1，2-丙二醇。
[0040]进一步优选地，本发明的混合液包括不同浓度梯度组成的多种混合液形成的一个混合液组合，优选由5?10种混合液组成，形成5?10级不同浓度的混合液。为了描述的方便，混合液组合中每一种混合液的浓度用其所含糖类的质量体积分数来表示。
[0041]优选地，所述混合液组合中所述各级浓度梯度组成的混合液的糖类浓度逐渐增力口，离液剂浓度逐渐降低。
[0042]再进一步优选地，本发明的混合液组合例如包括形成5级浓度梯度的5种混合液，其中糖类的质量体积分数分别为10-35 %、35-40 %、40-60 %、60-90 %、100 %，或者10-4040-6060-8080-90%、100%。最优选地，所述5级浓度梯度的5种混合液中糖类的质量体积分数分别为35%、40%、60%、80%、100%，或者40%、60%、80%、90%、100 %。离液剂的质量体积分数分别为45 %、45 %、35 %、25 %、10 %，抗氧化剂的质量体积分数均为0.5%。更优选地，糖类选用果糖，离液剂选用尿素，以及抗氧化剂选用3-巯基-1，2-丙二醇。
[0043]下面结合具体实例来阐述本发明的方法。本发明保留组织纹理结构的完整器官快速透明方法包括标本制备、本发明的混合液/混合液组合的配制、本发明的混合液/混合液组合处理器官三个步骤，下面区分体型较小和体型较大的哺乳动物进行详细阐述:
[0044]1.体型较小的成年哺乳动物的完整脑标本制备:
[0045]成年小鼠一只，体重约20g，用Iml注射器抽取I %戊巴比妥钠溶液0.2ml，腹腔注射麻醉。
[0046]待动物痛觉消失后，开胸充分暴露心脏，快速用装有I XPBS溶液(pH7.4)的注射器自左心室进行心脏穿刺，5分钟内均匀推注I X PBS溶液20ml，动物眼球、前肢及肝脏血色消失，继续灌注4%多聚甲醛溶液20ml (pH7.4，IXPBS配制)。刚开始灌注多聚甲醛时，可见到动物抽动、甩尾，之后动物肢体和尾巴绷直，提示灌注成功。
[0047]剪开颅骨，小心分离剪断与脑相连的颅神经，取出完整动物脑标本，浸入4%多聚甲醛溶液中，置于4°C冰箱内继续后固定2小时以上，最好过夜。
[0048]其中，体型较小的哺乳动物和体型较大的哺乳动物是本领域技术人员公知的根据经验来划分的，通常认为实验用动物中小鼠、大鼠等为体型较小的哺乳动物，兔、犬、马、牛、猴等为体型较大的哺乳动物。
[0049]2.体型较大的成年哺乳动物的完整脑标本制备:
[0050]成年大白兔一只，体重约2kg，用5ml注射器抽取3%戊巴比妥钠溶液2ml，耳缘静脉注射麻醉。
[0051]待动物痛觉消失后，分离双侧颈总动脉，血管夹钳夹近心端和远心端，在中间段血管管壁剪开一小口，远心端动脉插管，动脉插管连接预先装有I XPBS溶液(pH7.4)的输液装置，松开远心端血管夹，分离双侧颈深静脉并剪开。动物眼球变白后，继续灌注4%多聚甲醛溶液200ml (pH7.4，I XPBS配制)。刚开始灌注多聚甲醛时，可见到动物颈部肌肉收缩，之后动物前肢绷直，提示灌注成功。
[0052]从颈部剪断椎骨断头，保留颈总动脉插管备用，为避免破坏血管，暂不剪开颅骨取脑。
[0053]3.本发明的混合液和混合液组合的配制:
[0054]实施例1
[0055]对于本发明的混合液，作为一个具体实施例，例如糖类选择果糖单独一种，离液剂选择尿素单独一种，抗氧化剂选择3-巯基-1，2-丙二醇单独一种，配制10ml混合液，具体步骤如下:称取40克果糖、45克尿素溶解于90ml左右的双蒸水中，并加入0.5克3-巯基-1，2-丙二醇混合均匀，静置，待液面稳定后补加双蒸水将得到的溶液体积调整到10ml。
[0056]实施例2
[0057]对于本发明的混合液，作为另一个具体实施例，例如糖类选择1:1的果糖和蔗糖，离液剂选择硫脲单独一种，抗氧化剂选择硫辛酸单独一种，配制10ml混合液,具体步骤如下:称取30克果糖和30克蔗糖、35克硫脲溶解于90ml左右的双蒸水中，并加入0.5克硫辛酸混合均匀，静置，待液面稳定后补加双蒸水将得到的溶液体积调整到100ml。
[0058]上述实施例1、2仅是举例说明，对于其它浓度的本发明混合液，可以相同步骤将其溶解于双蒸水中混合均匀，静置后再调整体积到100ml。
[0059]实施例3
[0060]对于本发明的混合液组合，作为一个具体实施例，例如分为5级，每级浓度溶液各配制100ml。其中，糖类选择果糖单独一种，离液剂选择尿素单独一种，抗氧化剂选择3-巯基-1，2-丙二醇单独一种。称取如下表所示重量的果糖、尿素溶解于双蒸水中，并加入给定量的3-巯基-1，2-丙二醇混合均匀，静置待用。具体配方见下表。
[0061]
【权利要求】
1.一种保留组织纹理结构、使完整器官透明的混合液，包含糖类、离液剂和抗氧化剂。
2.根据权利要求1所述的保留组织纹理结构、使完整器官透明的混合液，其中所述糖类选自单糖和二糖中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的保留组织纹理结构、使完整器官透明的混合液，其中所述单糖为果糖。
4.根据权利要求2所述的保留组织纹理结构、使完整器官透明的混合液，其中所述二糖为蔗糖。
5.根据权利要求1所述的保留组织纹理结构、使完整器官透明的混合液，其中所述离液剂选自盐酸胍、氯化锂、尿素、硫脲中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的保留组织纹理结构、使完整器官透明的混合液，其中所述抗氧化剂选自巯基乙醇、3-巯基-1，2-丙二醇、硫辛酸中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的保留组织纹理结构、使完整器官透明的混合液，其中所述糖类的质量体积分数为10?100%。
8.根据权利要求1所述的混合液,其中所述离液剂的质量体积分数为5?50%。
9.根据权利要求1所述的混合液，其中所述抗氧化剂的质量体积分数为0.5?5%。
10.一种保留组织纹理结构、使完整器官透明的混合液组合，所述梯度混合液组合包括N种如权利要求1至9任一项所述的混合液，其中所述N种混合液的糖类浓度逐渐增加，离液剂浓度逐渐降低，N为2-20之间的正整数。
11.根据权利要求10所述的保留组织纹理结构、使完整器官透明的混合液组合，其中N为 5-10。
12.根据权利要求10所述的保留组织纹理结构、使完整器官透明的混合液组合，其中当N = 5时，所述N种混合液的糖类的质量体积分数分别为10-40%、40-60%、60-80%、80-90 %、100 %。
13.根据权利要求10所述的保留组织纹理结构、使完整器官透明的混合液组合，其中当N = 5时，所述N种混合液的糖类的质量体积分数分别为10-35%、35-40%、40-60%、60-90 %、100 %。
14.一种保留组织纹理结构、使完整器官透明的方法，包括下列步骤:使用如权利要求10至13任一项所述的混合液组合依次处理固定后的完整器官标本，实现透明；其中，体型较小动物的器官可依次在所述混合液组合的各种混合液中持续浸泡，体型较大动物的器官可依次经血管灌注所述混合液组合的各种混合液。
15.根据权利要求14所述的保留组织纹理结构、使完整器官透明的方法，其中先使用糖类浓度最小的混合液处理所述完整器官标本，再依次逐步使用浓度更大一级的混合液处理所述完整器官标本。
16.根据权利要求14或15所述的保留组织纹理结构、使完整器官透明的方法，其中对于浓度为10-40%的混合液需处理I?12小时，对于浓度为60-80%的混合液需处理I?4小时，浓度为100%的混合液需处理I?12小时。
17.根据权利要求14至16任一项所述的保留组织纹理结构、使完整器官透明的方法，其中在使用所述混合液组合的各种混合液处理完所述完整器官标本之后，再使用糖类浓度为100%的混合液浸泡12-24小时。
【文档编号】G01N1/28GK104198234SQ201410364956
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年7月29日 优先权日:2014年7月29日
【发明者】侯冰, 张丹, 蒋田仔 申请人:中国科学院自动化研究所