一种板蓝根药材的检测方法
【专利摘要】本发明属于中药材质量检测领域，具体涉及一种板蓝根的质量检测方法。该方法包括对板蓝根所含的尿苷、鸟苷、腺苷和总酸含量的测定以及对板蓝根农药残留量的测定。本发明解决了传统理化特性的鉴别方法的操作复杂和局限性以及质量难以调控的技术问题，以提供了一种准确度高，操作简便快速，成本低廉的检测方法，具有良好的应用前景和经济效益。
【专利说明】一种板蓝根药材的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于中药材质量检测领域，具体涉及一种板蓝根药材的质量检测方法。
【背景技术】
[0002] 板蓝根，常用别名靛青根、蓝靛根或大青根，是一种中药药材。中国各地均产。板 蓝根分为北板蓝根和南板蓝根，北板蓝根来源为十字花科植物菘蓝和草大青的根；南板蓝 根为爵床科植物马蓝的根茎及根。具有清热解毒、凉血消肿、利咽之功效。板蓝根是一种用 量极大且长期销售不衰的药材，纵观板蓝根的历史，我们可以看到其销量在飞速增长。板蓝 根含多种化学成分，主要含有尿苷、鸟苷、腺苷、总酸等。现代研究表明板蓝根含有的成分具 有广泛的生理活性作用，其含量与板蓝根的清热解毒等功效密切相关，因此其含量的多少 常作为板蓝根药材质量控制的重要指标。
[0003] 近几年板蓝根的市场需求量持续增加，野生资源逐年减少，人工栽培发展缓慢，使 得板蓝根资源蕴藏量和产量都在大幅下降。导致市场上出现了很多伪品，其中不少伪品的 农药残留量超标爆表，给板蓝根药材的质量、用药的安全性及有效性带来了很大的冲击，已 成为制约板蓝根系列药材开发的瓶颈。
[0004]目前，正品板蓝根的有效检测方法是传统的形态特征和理化特性的鉴别方法，具 有一定的局限性，不足以从整体上控制板蓝根的质量，作为一味临床常用中药，其真伪优劣 受其理化指标、农药残留量多等诸多因素的影响，因此有必要建立一种科学的质量检测方 法对板蓝根的质量进行评价。
【发明内容】
[0005] 为此，本发明所要解决的技术问题在于现有技术中板蓝根药材检测方法复杂，质 量难以调控的问题，进而提供一种准确度高，简单、快速的检测板蓝根药材的方法。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明是通过如下技术方案实现的：
[0007] 本发明提供了一种板蓝根药材的检测方法，该方法包括如下有效成分含量的测定 步骤以及农药残留量的测定步骤，其中：
[0008]A:尿苷、鸟苷、腺苷含量的测定包括如下步骤：
[0009] (1)分别精密称取鸟苷对照品3. 56mg、尿苷对照品4. 60mg和腺苷对照品4. 49mg， 加甲醇制成每lmL分别含22. 78yg、29. 40yg和含28. 74yg的混合对照品溶液；
[0010] (2)精密称取板蓝根药材粉末0. 5g，精密加入水25mL，超声40分钟；取上清液，经 0. 45ym滤膜滤过，取续滤液，得供试品溶液的制备；
[0011] (3)照高效液相色谱法试验，以十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以乙腈为流动相 A、以水为流动相B按照如下程序进行梯度洗脱：2-20min，A:B为2%:98% - 40%:60%;控 制柱温为30°C，流量为0? 6mL/分钟进行检测，检测波长分别为：0min，254nm;7min，262nm; 8min，246nm;10min，259nm;12min，254nm;
[0012]分别取对照品溶液与供试品溶液各10yi，注入液相色谱仪，测定；
[0013] B:所述总酸含量的测定包括如下步骤：
[0014] (1)精密称取待测板蓝根药材5g，加70%乙醇置水浴上加热回流提取3次，每次 50ml且每次回流1. 5小时，滤过，60°C时，滤液浓缩至相对密度1. 05,浓盐酸调pH至2?3， 用乙酸乙酯萃取，减压回收乙酸乙酯至干，加70%乙醇溶解定容至25ml，得到供试品溶液；
[0015] (2)总有机酸以水杨酸计，采用直接滴定法测定其总有机酸的含量；
[0016] C:所述农药残留量的测定包括如下步骤：
[0017] (1)精密称取三苯基磷酸酯适量，加丙酮制成每1ml含100yg三苯基磷酸酯的溶 液，作为内标贮备液；
[0018] 分别精密量取各农药对照品贮备溶液1ml及所述内标贮备液1ml，加丙酮定容至 100ml，作为混合对照品贮备溶液；分别精密量取适量，加乙腈定容制成20-1000ng/ml的不 同浓度的溶液，作为混合对照品溶液；
[0019] 另取核糖酸内酯适量，加乙腈溶解制成每1ml含20mg核糖酸内酯的溶液，另取山 梨醇适量，加水溶解制成每lml含山梨醇10mg的溶液；分别精密量取上述核糖酸内酯、山梨 醇溶液各lml混勻，加乙腈定容至10ml，作为分析保护剂；
[0020] (2)精密称取待测药材细粉10g，并加入氯化钠lg混匀，精密加入丙酮100ml，冰 浴超声处理30分钟，离心，将上清液迅速移入装有lg无水硫酸钠的具塞锥形瓶中，放置30 分钟；随后精密量取上述溶液60ml减压浓缩至近干，并加入体积比为1 :1的环已烷-乙酸 乙酯溶液溶解样品并定容至l〇ml，过滤后取滤液经GPC凝胶渗透色谱净化，以体积比为1: 1的环已烷-乙酸乙酯溶液为流动相洗脱，收集洗脱液，移入KD瓶中，减压浓缩至近干；
[0021] 向上述样品中加入体积比为1 :1的乙酸乙酯-丙酮混合溶液5ml溶解，并转移至 石墨碳-氨基混合固相萃取小柱上，以体积比为1 :1的乙酸乙酯-丙酮混合溶液15ml洗 脱，收集洗脱液，氮吹至近干，随后加入所述内标贮备液5yl，加乙腈定容至lml，作为供试 品溶液；
[0022] (3)精密量取上述各浓度混合对照品溶液及供试品溶液各400yL，并分别加入所 述分析保护剂1〇〇UL混匀，随后分别精密吸取1yL，进行气相色谱-质谱联用仪测定；其 中，
[0023] 所述气相色谱分析条件为：取规格为30mX0. 25mmX0. 25um的弹性石英毛细管柱 DB17ms，以高纯氦气为载气，柱流速1. 3ml/分钟，进样量1yl，采用高压不分流进样，设置 进样口温度为230°C，升温程序具体为：初始温度60°C，以30°C/分钟升至120°C、以10°C/ 分钟升至200°C、以2°C/分钟升至230°C、以30°C/分钟升至300°C，并保持7分钟；
[0024] 所述EI源质谱测定的条件为：设置电子能量70eV，离子源温度230°C，接口温度 250。。。
[0025] 其中，所述农药残留量的测定中，所述GPC凝胶渗透色谱净化步骤的条件具体为： 填料为Bio-BeadsS-X3 200-400目，净化柱为2. 5mmX40cm，具体洗脱参数为：净化去杂 900s，目标物收集1200s，柱子清洗300s。
[0026]更进一步的，所述农药残留量的测定中，所述农药对照品包括敌敌畏、甲胺磷、乙 酰甲胺磷、四氯硝基苯、六氯苯、a-六六六、六六六、六六六、6-六六六、氧化乐 果、二嗪磷、五氯硝基苯、久效磷、地虫硫磷、磷胺I、乐果、七氯、五氯苯胺、百菌清、甲基毒死 蜱、艾氏剂、克菌丹、磷胺II、甲基对硫磷、甲基嘧啶磷、甲基五氯苯基硫醚、甲霜灵、三唑酮、 毒死蜱、马拉硫磷、杀螟硫磷、对硫磷、二甲戊灵、顺式环氧七氯、反式环氧七氯、三唑醇A、三 唑醇B、反式氯丹、顺式硫丹、顺式氯丹、反式硫丹、pp' -DDE、PP' -DDD、OP' -DDT、PP' -DDT、狄 氏剂、杀扑磷、异狄氏剂、乙硫磷、三苯基磷酸酯、联苯菊酯、硫丹硫酸酯、异菌脲、甲氰菊酯、 三氯杀螨醇、氯氟氰菊酯、甲氧DDT、三氯杀螨砜、伏杀硫磷、氯菊酯1、氯菊酯2、氯氰菊酯、 氰戊菊酯、溴氰菊酯。
[0027] 其中，步骤B中，所述总酸含量的测定，具体步骤为：
[0028] 取供试品溶液5ml置三角瓶中，加入酚酞指示剂2滴，用标定好的0.lmol/L氢氧 化钠滴定液滴定，滴定至溶液显粉红色时为终点，每lml氢氧化钠滴定液相当于14. 088mg 的水杨酸。
[0029] 其中，步骤A中，所述板蓝根甲苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、板蓝根皂苷II、板蓝根 皂苷III含量的测定中，所述待测药材的粒径为180-2000iim。
[0030] 步骤C中，所述农药残留量的测定中，所述待测药材的粒径为180-2000i!m。
[0031] 本发明所述方法通过对板蓝根药材所含的板蓝根有效成分含量的测定以及对板 蓝根药材农药残留量的检测，进行板蓝根药材真伪优劣的判定标准。并通过高效液相色谱 法测定板蓝根有效成分的含量，所述方法不仅准确且简单易行。本发明所述方法通过气相 色谱-质谱联用的方式检测药材的残留农药量，不仅检测的准确度高，方法简单、快速，而 且通过对检测条件的特定筛选，可一次性将板蓝根药材中常见的农药种类进行一次性的有 效检测，所述方法准确率及实用效果均较好。
【专利附图】
【附图说明】
[0032] 为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实验例并结合 附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：
[0033] 图1是本发明实施例1对照品的HPLC图谱（1-鸟苷，2-尿苷，3-腺苷）；
[0034] 图2是本发明实施例1样品的HPLC图谱（1-鸟苷，2-尿苷，3-腺苷）；
[0035]图3是本发明实施例3中农药标准品的全扫描气相色谱图；
[0036] 图4是本发明实施例3中农药标准品的0-10分钟扫描气相色谱图；
[0037] 图5是本发明实施例3中农药标准品的10-20分钟扫描气相色谱图；
[0038] 图6是本发明实施例3中农药标准品的20-40分钟扫描气相色谱图。
【具体实施方式】
[0039] 实施例1板蓝根药材中板蓝根甲苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、板蓝根皂苷II、板蓝 根皂苷III含量的测定
[0040] 1?仪器与试药
[0041] 1.1 仪器
[0042]waters2695-2998高效液相色谱仪，超声清洗器（250W，40kHz)。
[0043] 1. 2 试药
[0044] 鸟苷对照品（A0778,纯度98.4%，天津马克生物有限公司），尿苷对照品 (887-200001，中国药品生物制品检定所），腺苷对照品（110879-200202,中国食品药品检 定研究院）。
[0045] 甲醇、乙腈为色谱纯、水为纯净水，乙醇为分析纯。
[0046] 1. 3药材样品
[0047] 收集了各地板蓝根样品，供试药材产地批次分别选自：陇西首阳2批次，分别标注 为1-2、甘肃陇西首阳董家堡、甘肃陇西首阳菜子坪、甘肃渭源会川、甘肃临洮、甘肃渭源2 批次，分别标注为1-2、渭源莲峰绽坡村3批次，分别标注为1-3、甘肃商品。
[0048] 2?方法
[0049] 2. 1对照品溶液的制备
[0050] 分别精密称取鸟苷对照品3. 56mg、尿苷对照品4. 60mg和腺苷对照品4. 49mg，加甲 醇制成每lmL分别含22. 78yg、29. 40yg和含28. 74yg混合对照品溶液，即得对照品溶 液。
[0051] 2. 2供试品溶液的制备
[0052] 取板蓝根药材粉碎（过四号筛）约0? 5g，精密称定，精密加入水25mL，超声40min。 取上清液，经0. 45ym滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
[0053] 2. 3色谱条件
[0054] 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈（A)-水（B)为流动相按下表进行梯度 洗脱（见表1);检测波长采用多波长检测（见表2);柱温为30°C;流量0? 6mL/min。
[0055] 表1含量测定洗脱梯度
【权利要求】
1. 一种板蓝根药材的检测方法，其特征在于，该方法包括如下有效成分含量的测定步 骤以及农药残留量的测定步骤以及农药残留量的测定步骤，其中， A :尿苷、鸟苷、腺苷含量的测定包括如下步骤： (1) 分别精密称取鸟苷对照品3. 56mg、尿苷对照品4. 60mg和腺苷对照品4. 49mg，加甲 醇制成每lmL分别含22. 78 y g、29. 40 y g和含28. 74 y g的混合对照品溶液； (2) 精密称取板蓝根药材粉末0. 5g，精密加入水25mL，超声40分钟；取上清液，经 0. 45 y m滤膜滤过，取续滤液，得供试品溶液的制备； (3) 照高效液相色谱法试验，以十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以乙腈为流动相A、以 水为流动相B按照如下程序进行梯度洗脱：2-20min，A :B为2% :98% - 40% :60% ;控制 柱温为30°C，流量为0? 6mL/分钟进行检测，检测波长分别为：0min，254nm ;7min，262nm ; 8min,246nm ； lOmin,259nm ； 12min,254nm ； 分别取对照品溶液与供试品溶液各l〇u 1，注入液相色谱仪，测定； B :所述总酸含量的测定包括如下步骤： (1) 精密称取待测板蓝根药材5g，加70%乙醇置水浴上加热回流提取3次，每次50ml 且每次回流1. 5小时，滤过，60°C时，滤液浓缩至相对密度1. 05,浓盐酸调pH至2?3,用乙 酸乙酯萃取，减压回收乙酸乙酯至干，加70%乙醇溶解定容至25ml，得到供试品溶液； (2) 总有机酸以水杨酸计，采用直接滴定法测定其总有机酸的含量； C :所述农药残留量的测定包括如下步骤： (1) 精密称取三苯基磷酸酯适量，加丙酮制成每lml含100 y g三苯基磷酸酯的溶液，作 为内标贮备液； 分别精密量取各农药对照品贮备溶液lml及所述内标贮备液lml，加丙酮定容至 100ml，作为混合对照品贮备溶液；分别精密量取适量，加乙腈定容制成20-1000ng/ml的不 同浓度的溶液，作为混合对照品溶液； 另取核糖酸内酯适量，加乙腈溶解制成每lml含20mg核糖酸内酯的溶液，另取山梨醇 适量，加水溶解制成每lml含山梨醇10mg的溶液；分别精密量取上述核糖酸内酯、山梨醇溶 液各lml混勻，加乙腈定容至10ml，作为分析保护剂； (2) 精密称取待测药材细粉10g，并加入氯化钠 lg混匀，精密加入丙酮100ml，冰浴超声 处理30分钟，离心，将上清液迅速移入装有lg无水硫酸钠的具塞锥形瓶中，放置30分钟； 随后精密量取上述溶液60ml减压浓缩至近干，并加入体积比为1 :1的环已烷-乙酸乙酯溶 液溶解样品并定容至l〇ml，过滤后取滤液经GPC凝胶渗透色谱净化，以体积比为1 :1的环 已烷-乙酸乙酯溶液为流动相洗脱，收集洗脱液，移入KD瓶中，减压浓缩至近干； 向上述样品中加入体积比为1 :1的乙酸乙酯-丙酮混合溶液5ml溶解，并转移至石墨 碳-氨基混合固相萃取小柱上，以体积比为1 :1的乙酸乙酯-丙酮混合溶液15ml洗脱，收集 洗脱液，氮吹至近干，随后加入所述内标贮备液5iU，加乙腈定容至lml，作为供试品溶液； (3) 精密量取上述各浓度混合对照品溶液及供试品溶液各400 y L，并分别加入所述分 析保护剂1〇〇 U L混匀，随后分别精密吸取1 y L，进行气相色谱-质谱联用仪测定；其中， 所述气相色谱分析条件为：取规格为30mX0. 25mmX0. 25um的弹性石英毛细管柱 DB17ms，以高纯氦气为载气，柱流速1.3ml/分钟，进样量liU，采用高压不分流进样，设置 进样口温度为230°C，升温程序具体为：初始温度60°C，以30°C /分钟升至120°C、以10°C / 分钟升至200°C、以2°C /分钟升至230°C、以30°C /分钟升至300°C，并保持7分钟； 所述EI源质谱测定的条件为：设置电子能量70eV，离子源温度230°C，接口温度 250。。。
2. 根据权利要求1所述的板蓝根药材的检测方法，其特征在于，所述农药残留量的测 定中，所述GPC凝胶渗透色谱净化步骤的条件具体为：填料为Bio-Beads S-X3 200-400 目，净化柱为2. 5mmX 40cm，具体洗脱参数为：净化去杂900s，目标物收集1200s，柱子清洗 300s〇
3. 根据权利要求1或2所述的板蓝根药材的检测方法，其特征在于，所述农药残 留量的测定中，所述农药对照品包括敌敌畏、甲胺磷、乙酰甲胺磷、四氯硝基苯、六氯苯、 a-六六六、￠-六六六、六六六、S-六六六、氧化乐果、二嗪磷、五氯硝基苯、久效磷、 地虫硫磷、磷胺I、乐果、七氯、五氯苯胺、百菌清、甲基毒死蜱、艾氏剂、克菌丹、磷胺II、甲 基对硫磷、甲基嘧啶磷、甲基五氯苯基硫醚、甲霜灵、三唑酮、毒死蜱、马拉硫磷、杀螟硫磷、 对硫磷、二甲戊灵、顺式环氧七氯、反式环氧七氯、三唑醇A、三唑醇B、反式氯丹、顺式硫丹、 顺式氯丹、反式硫丹、PP' _DDE、PP' -DDD、0P' -DDT、PP' -DDT、狄氏剂、杀扑磷、异狄氏剂、乙硫 磷、三苯基磷酸酯、联苯菊酯、硫丹硫酸酯、异菌脲、甲氰菊酯、三氯杀螨醇、氯氟氰菊酯、甲 氧DDT、三氯杀螨砜、伏杀硫磷、氯菊酯1、氯菊酯2、氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯。
4. 根据权利要求1-3任一所述的板蓝根药材的检测方法，其特征在于，所述总酸含量 的测定，具体步骤为： 取供试品溶液5ml置三角瓶中，加入酚酞指示剂2滴，用标定好的0. lmol/L氢氧化钠 滴定液滴定，滴定至溶液显粉红色时为终点，每lml氢氧化钠滴定液相当于14. 088mg的水 杨酸。
5. 根据权利要求1-4任一所述的板蓝根药材的检测方法，其特征在于，所述板蓝根甲 苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、板蓝根皂苷II、板蓝根皂苷III含量的测定中，所述待测药材的粒 径为 180-2000 ii m。
6. 根据权利要求1-5任一所述的板蓝根药材的检测方法，其特征在于，所述农药残留 量的测定中，所述待测药材的粒径为180-2000 y m。
【文档编号】G01N30/02GK104458931SQ201410374924
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年7月31日 优先权日:2014年7月31日
【发明者】宋平顺, 李登鹏, 陈杰, 韩斌, 李波, 赵建邦, 李士博, 李冬华, 张明童 申请人:甘肃中天药业有限责任公司