一种大黄药材的检测方法
【专利摘要】本发明属于中药材质量检测领域，具体涉及一种大黄药材的检测方法，该检测方法包括土大黄苷的鉴别、没食子酸和儿茶素的含量测定和农药残留量检测。本发明不仅检测的准确度高，方法简单、快速，而且可一次性将大黄药材中常见的农药种类进行一次性的有效检测，可同时完成多个检测指标，更有利于对大黄药材质量的控制，有助于提高该药物使用的安全性和稳定性。
【专利说明】一种大黄药材的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于中药材质量检测领域，具体涉及一种大黄药材的质量检测方法。
【背景技术】
[0002] 大黄为寥科植物药用大黄Rheum officinale Baill.、掌叶大黄Rheum palmatumL. 或唐古特大黄Rheum tanguticum Maxim.ex Balf?的干燥根及根莖。味苦性寒，归脾、胃、 大肠、肝、心包经；《千金方》记载为锦纹大黄；《吴普本草》记载为黄良、火参、肤如；李当之 《药录》记载为"将军";而《中药材手册》则记载为川军；主要功效：泻下积滞、清热泻火、凉 血解毒、逐癖通经。主要产于青海、甘肃、四川等地区，有野生也有栽培,药材以质地坚实、 断面"锦纹"（异形维管束）明显、红综色、稍有油性、气清香、味苦而微涩、嚼之粘牙者为佳。 有关大黄的药效和临床使用，历代本草、医籍很多都有记载。《神农本草经》载："味苦寒，归 胃、肝大肠经。主下癖血，血闭寒热，留饮宿食，荡涤肠胃，推陈致新，通利水谷，调中化食，安 和五脏"；《名医别录》载："大寒，无毒。平胃下气，除痰实，肠间结热，心腹胀满，女子寒血 闭胀，小腹痛，诸老血留结"；《药性论》载："使，去寒热，忌冷水，味苦，甘。消食，涤五藏，通 女子经候，利水肿，能破痰实，冷热结聚宿食，利大小肠贴热毒肿。主小儿寒热，时疾烦热，饮 脓，破留血"；《药性赋》载："味苦，气寒，无毒。其性沉而不浮，其用走而不守。夺土郁而无 拥滞，定祸乱而致太平，名之日将军";《本草纲目》载："通宣一切气，调血脉，利关节";《本草 备要》载："大泻血分湿热，下有形积滞"。
[0003] 中药材的质量直接影响中药产品的品质及药效，衡量中药材质量标准除中药自身 的有效成分外，还包括化学农药及重金属的污染情况。近年来，中药领域的大力发展以及中 药材需求量的加大，导致大量伪劣药材的上市，其中不少伪品的农药残留量严重超标，给大 黄药材的质量、用药的安全性及有效性造成了很大的冲击。药材农药残留问题日益引起世 界各国的重视，国际上从1970年起开始研究药材农药残留量问题，1980年世界卫生组织将 农药残留测定单独列为检测项目，近年来成为世界性的研究热点。
[0004] 但是，现存的大黄药材的检测方法或者只进行有效成分的含量测定，或者只测定 其农药残留量，检测指标比较单一，而且对农药的检测也大多借鉴于其他产品的检测方法， 并没有针对大黄药材常见农药的一次性检出方法，导致对于大黄药材常见农药的检测需要 多次检测才能完全，不利于大黄药材的质量控制以及大黄使用的安全性和稳定性。因此，建 立一种快速、全面、针对性强的大黄药材的质量检测方法具有重要的意义。
【发明内容】
[0005] 为此，本发明所要解决的技术问题在于现有技术中大黄药材检测指标单一，不利 于大黄药材的质量控制，进而提供一种快速、全面、针对性强的大黄药材的检测方法。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明是通过如下技术方案实现的：
[0007] 本发明的大黄药材的检测方法，该检测方法包括如下有效成分的鉴别及含量测定 步骤以及农药残留量检测的步骤，其中，
[0008] A、土大黄苷的鉴别包括以下步骤：
[0009] (1)取土大黄苷对照品，加甲醇制成每ImL含0. 3mg 土大黄苷的溶液，作为对照品 溶液；
[0010] ⑵另取待测药材粉末〇. 5g，加甲醇15mL，加热回流、放冷并滤过，滤液作为供试 品溶液；
[0011] (3)照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液和对照品溶液各2 y L，分别点于同 一硅胶G薄层板上，以体积比100 :30 :2 :3的三氯甲烷-甲醇-甲酸-水为展开剂，展开， 取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；
[0012] B、没食子酸和儿茶素的含量测定包括以下步骤：
[0013] (1)精密称取没食子酸与儿茶素对照品适量，用50%甲醇溶解，制成含没食子酸 0? 106mg/mL与儿茶素0? 115mg/mL的混合对照；
[0014] (2)精密称取待测药材细粉0. 5g，置锥形瓶中，精密加入25mL20%甲醇溶液，超声 40分钟，滤过，取续滤液，用0. 45 ii m微孔滤膜过滤，滤液作为供试溶液；
[0015] (3)照高效液相色谱法试验，以waters C18柱为色谱柱，以甲醇为流动相A，以体 积浓度〇. 1 %的磷酸为流动相B，控制流速ImL/分钟进行梯度洗脱，具体梯度洗脱程序如 下：从0-10分钟，流动相A :流动相B的体积比为8 % :92% ;从10-30分钟，流动相A :流 动相B的体积比由8% :92% - 30% :70% ;从30-35分钟，流动相A :流动相B的体积比由 30% :70% - 40% :60% ;从35-40分钟，流动相A :流动相B的体积比由40% :60% - 8% : 92% ;从40-50分钟，流动相A :流动相B的体积比为8% :92% ;
[0016] 精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5 ii L，注入高效液相色谱仪，于280nm波长 下测定；
[0017] C、农药残留量检测包括以下步骤：
[0018] (1)精密称取三苯基磷酸酯适量，加丙酮制成每ImL含IOOil g三苯基磷酸酯的溶 液，作为内标贮备液；
[0019] 分别精密量取各农药对照品贮备溶液ImL及上述内标贮备液lmL，加丙酮定容至 IOOmL,作为混合对照品贮备溶液；分别精密量取适量，加乙腈定容制成20-1000ng/mL的不 同浓度的溶液，作为混合对照品溶液；
[0020] 另取核糖酸内酯适量，加乙腈溶解制成每ImL含20mg核糖酸内酯的溶液，另取山 梨醇适量，加水溶解制成每ImL含山梨醇IOmg的溶液；分别精密量取上述核糖酸内酯、山梨 醇溶液各ImL混勻，加乙腈定容至IOmL,作为分析保护剂；
[0021] (2)精密称取待测药材细粉10g，并加入氯化钠Ig混匀，精密加入丙酮IOOmLjK 浴超声处理30分钟，离心，将上清液迅速移入装有Ig无水硫酸钠的具塞锥形瓶中，放置30 分钟；随后精密量取上述溶液60mL减压浓缩至近干，并加入体积比为1 :1的环已烷-乙酸 乙酯溶液溶解样品并定容至10mL，过滤后取滤液经GPC凝胶渗透色谱净化，以体积比为1 : 1的环已烷-乙酸乙酯溶液为流动相洗脱，收集洗脱液，移入KD瓶中，减压浓缩至近干；
[0022] 向上述样品中加入体积比为1 :1的乙酸乙酯-丙酮混合溶液5mL溶解，并转移至 石墨碳-氨基混合固相萃取小柱上，以体积比为1 :1的乙酸乙酯-丙酮混合溶液15mL洗 脱，收集洗脱液，氮吹至近干，随后加入上述内标贮备液5 y L，加乙腈定容至lmL，作为供试 品溶液；
[0023] (3)精密量取上述各浓度混合对照品溶液及供试品溶液各400 y L，并分别加入上 述分析保护剂1〇〇 U L混匀，随后分别精密吸取I y L，进行气相色谱-质谱联用仪测定；其 中，
[0024] 气相色谱分析条件为：取规格为30mX0. 25mmX0. 25um的弹性石英毛细管柱 DB17ms，以高纯氦气为载气，柱流速I. 3mL/分钟，进样量I ii L，采用高压不分流进样，设置 进样口温度为230°C，升温程序具体为：初始温度60°C，以30°C /分钟升至120°C、以KTC / 分钟升至200°C、以2°C /分钟升至230°C、以30°C /分钟升至300°C，并保持7分钟；
[0025] EI源质谱测定的条件为：设置电子能量70eV，离子源温度230°C，接口温度250°C。
[0026] 本发明的大黄药材的检测方法，农药残留量检测中，上述GPC凝胶渗透色谱净化 步骤的条件具体为：填料为Bio-Beads S-X3200-400目，净化柱为2. 5_X40cm，具体洗脱 参数为净化去杂900s，目标物收集1200s，柱子清洗300s。
[0027] 本发明的大黄药材的检测方法，农药残留量检测中，上述农药对照品包括敌敌畏、 甲胺磷、乙酰甲胺磷、四氯硝基苯、六氯苯、a -六六六、0 -六六六、Y-六六六、6 -六六六、 氧化乐果、二嗪磷、五氯硝基苯、久效磷、地虫硫磷、磷胺I、乐果、七氯、五氯苯胺、百菌清、甲 基毒死蜱、艾氏剂、克菌丹、磷胺II、甲基对硫磷、甲基嘧啶磷、甲基五氯苯基硫醚、甲霜灵、 三唑酮、毒死蜱、马拉硫磷、杀螟硫磷、对硫磷、二甲戊灵、顺式环氧七氯、反式环氧七氯、三 唑醇A、三唑醇B、反式氯丹、顺式硫丹、顺式氯丹、反式硫丹、pp' -DDE、PP' -DDD、OP' -DDT、 PP' -DDT、狄氏剂、杀扑磷、异狄氏剂、乙硫磷、三苯基磷酸酯、联苯菊酯、硫丹硫酸酯、异菌 脲、甲氰菊酯、三氯杀螨醇、氯氟氰菊酯、甲氧DDT、三氯杀螨砜、伏杀硫磷、氯菊酯1、氯菊酯 2、氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯。
[0028] 本发明的大黄药材的检测方法，没食子酸和儿茶素的含量测定中，上述供试品制 备的超声条件为功率200W，频率40kHz。
[0029] 本发明的大黄药材的检测方法，农药残留量检测中，上述待测药材的粒径为 180-2000 u m〇
[0030] 本发明通过对大黄药材所含的有效成分的鉴别、有效成分含量的测定以及对大黄 药材农药残留量的检测，进行大黄药材真伪优劣的判定标准。本发明上述方法通过薄层色 谱法鉴别土大黄苷、高效液相色谱法检测没食子酸和儿茶素的含量，不仅准确且简单易行。 本发明通过气相色谱_质谱联用的方式检测药材的残留农药量，不仅检测的准确度高，方 法简单、快速，而且通过对检测条件的特定筛选，可一次性将大黄药材中常见的农药种类进 行一次性的有效检测，可同时完成多个检测指标，上述方法准确率及实用效果均较好，更有 利于对大黄药材质量的控制，有助于提高该药物使用的安全性和稳定性。
【专利附图】
【附图说明】
[0031] 为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合 附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：
[0032] 图1为实施例1中各样品薄层色谱图，其中化合物1-3为正品大黄，化合物S为土 大黄苷对照品，化合物4-7为河套大黄；
[0033] 图2 (a)为实施例2中大黄对照品的HPLC图，图2 (b)为实施例2中大黄供试品的 HPLC图,其中A为混合对照品，B为供试品，1为没食子酸,2为儿茶素；
[0034] 图3为实施例3中农药标准品的全扫描气相色谱图；
[0035] 图4为实施例3中农药标准品的0-10分钟扫描气相色谱图；
[0036] 图5为实施例3中农药标准品的10-20分钟全扫描气相色谱图；
[0037] 图6为实施例3中农药标准品的20-40分钟全扫描气相色谱图。
【具体实施方式】
[0038] 下述实施例用于进一步说明本发明但不限于本发明。
[0039] 实施例1大黄药材中土大黄苷的鉴别
[0040] 本实施例按照如下方法对正品大黄、伪品大黄（河套大黄）进行比较鉴别：
[0041] 1、供试品溶液的制备
[0042] 取土大黄苷对照品，加甲醇制成每ImL含0. 3mg的溶液，作为对照品溶液。
[0043] 2、对照品溶液的制备
[0044] 另取各待测药材粉末0. 5g，加甲醇15mL，加热回流30分钟，放冷，滤过，滤液作为 供试品溶液。
[0045] 3、测定法
[0046] 照薄层色谱法（中国药典附录VI B)试验，吸取上述对照品溶液和供试品溶液各 2 U L，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比100 :30 :2 :3的三氯甲烷-甲醇-甲酸-水 为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视。
[0047] 鉴别检测的结果见图1所示。正品大黄供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位 置上，不得显相同的颜色荧光斑点。土大黄苷为土大黄（大黄伪品）的特征斑点。在s(土 大黄苷）相对应的位置，1-3号大黄样品未出现斑点。可知该鉴别方法科学、准确、简便。
[0048] 实施例2没食子酸和儿茶素的含量测定
[0049] 1仪器与试药
[0050] I. 1 仪器
[0051] 高效液相色谱仪（717plus Autosampler，515HPLC Pump，2487 紫外检测器；waters 公司），超声波清洗器（HS10260D型，昆山市超声仪器有限公司）
[0052] 1. 2 试药
[0053] 没食子酸对照品（0831-9501)和儿茶素对照品（877-200001)均由中国食品药品 检定研究院提供；甲醇为色谱纯，水为纯净水。
[0054] 供试品为选自不同产地的大黄药材，共计21批次。
[0055] 2方法与结果
[0056] 2.1对照品溶液制备
[0057] 精密称取没食子酸与儿茶素对照品适量，用50%甲醇溶解，定容，制成含没食子酸 0? 106mg/mL与儿茶素0? 115mg/mL的混合对照溶液。
[0058] 2. 2供试品溶液制备
[0059] 精密称取各批次待测大黄药材细粉0. 5g，置锥形瓶中，精密加入25mL20%甲醇溶 液，超声40分钟，滤过，取续滤液，用0. 45 y m微孔滤膜过滤，即得。
[0060] 2. 3色谱条件
[0061] 照高效液相色谱法试验，以waters C18柱为色谱柱，以甲醇为流动相A，以体积浓 度0. I %的磷酸为流动相B，控制流速ImL/分钟进行梯度洗脱，具体梯度洗脱程序如下：从 0-10分钟，流动相A :流动相B的体积比为8% :92% ;从10-30分钟，流动相A :流动相B的 体积比由8% :92% - 30% :70% ;从30-35分钟，流动相A :流动相B的体积比由30% :70% -40 % :60 % ;从35-40分钟，流动相A :流动相B的体积比由40 % :60 % - 8 % :92 % ;从 40-50分钟，流动相A :流动相B的体积比为8% :92% ;
[0062] 精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5 ii L，注入高效液相色谱仪，于280nm波长 下测定。
[0063] 2. 4标准曲线绘制
[0064] 取2. 1中制备的混合对照溶液，依次进样2、5、10、15、20、30ii L，注入高效液相色 谱仪，按2. 3项下色谱条件测定峰面积；用峰面积Y对进样体积X进行线性回归，得没食子 酸与儿茶素的回归方程分别为 Y = I. 0748X+4. 6544 (r = 0. 9999) ;Y = I. 0698X+4. 0741 (r =0. 9999)。没食子酸在0. 212-3. 183 ii g、儿茶素在0. 230-3. 451 ii g范围内线性关系良好。
[0065] 2. 5方法学验证
[0066] 2. 5. 1精密度实验
[0067] 精密吸取质量浓度为0. 106mg 1171和0. 115mg 1171的没食子酸与儿茶素的混合 对照品溶液5 y L，按上述色谱条件重复进样6次，没食子酸的RSD为1. 22%，儿茶素的RSD 为 0? 74%。
[0068] 2. 5. 2稳定性实验
[0069] 取同一份供试品溶液，在0、4、8、12、16、20、24h按2. 1项下色谱条件进样，按峰面 积计算，没食子酸的RSD为4. 01 %，儿茶素为4. 52%，表明供试品溶液在24h内稳定。
[0070] 2. 5. 3重复性实验
[0071] 取同一批要样品按2. 3供试品溶液制备方法平行制备5份，按上述色谱条件测定， 得没食子酸RSD = 3. 63 %，儿茶素RSD = 2. 21 %。
[0072] 2. 5. 4加样回收率实验
[0073] 精密称取同一批样品称取5份，每份约0. 25g，精密加入没食子酸对照品I. 958g， 儿茶素对照品5. 810g，按上述方法制备供试品溶液，再按上述条件测定，结果见表1。
[0074] 表1加样回收率（n = 5)
[0075]
【权利要求】
1. 一种大黄药材的检测方法，其特征在于，该检测方法包括如下有效成分的鉴别及含 量测定步骤以及农药残留量检测的步骤，其中， A、 土大黄苷的鉴别包括以下步骤： (1) 取土大黄苷对照品，加甲醇制成每lmL含0. 3mg 土大黄苷的溶液，作为对照品溶 液； (2) 另取待测药材粉末0. 5g，加甲醇15mL，加热回流、放冷并滤过，滤液作为供试品溶 液； (3) 照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液和对照品溶液各2 y L，分别点于同一硅 胶G薄层板上，以体积比100 :30 :2 :3的三氯甲烷-甲醇-甲酸-水为展开剂，展开，取出， 晾干，置365nm紫外光灯下检视； B、 没食子酸和儿茶素的含量测定包括以下步骤： (1)精密称取没食子酸与儿茶素对照品适量，用50%甲醇溶解，制成含没食子酸 0? 106mg/mL与儿茶素0? 115mg/mL的混合对照； ⑵精密称取待测药材细粉〇. 5g，置锥形瓶中，精密加入25mL20 %甲醇溶液，超声40分 钟，滤过，取续滤液，用0. 45 ii m微孔滤膜过滤，滤液作为供试溶液； (3)照高效液相色谱法试验，以waters C18柱为色谱柱，以甲醇为流动相A，以体积浓 度0. 1 %的磷酸为流动相B，控制流速lmL/分钟进行梯度洗脱，具体梯度洗脱程序如下：从 0-10分钟，流动相A :流动相B的体积比为8% :92% ;从10-30分钟，流动相A :流动相B的 体积比由8 % :92 % - 30 % :70 % ;从30-35分钟，流动相A :流动相B的体积比由30 % :70 % -40% :60% ;从35-40分钟，流动相A :流动相B的体积比由40% :60% - 8 % :92% ;从 40-50分钟，流动相A :流动相B的体积比为8% :92% ; 精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5 y L，注入高效液相色谱仪，于280nm波长下测 定； C、 农药残留量检测包括以下步骤： (1) 精密称取三苯基磷酸酯适量，加丙酮制成每lmL含100 y g三苯基磷酸酯的溶液，作 为内标贮备液； 分别精密量取各农药对照品贮备溶液lmL及所述内标贮备液lmL，加丙酮定容至 100mL，作为混合对照品贮备溶液；分别精密量取适量，加乙腈定容制成20-1000ng/mL的不 同浓度的溶液，作为混合对照品溶液； 另取核糖酸内酯适量，加乙腈溶解制成每lmL含20mg核糖酸内酯的溶液，另取山梨醇 适量，加水溶解制成每lmL含山梨醇10mg的溶液；分别精密量取上述核糖酸内酯、山梨醇溶 液各lmL混勻，加乙腈定容至lOmL，作为分析保护剂； (2) 精密称取待测药材细粉10g，并加入氯化钠lg混匀，精密加入丙酮100mL，冰浴超声 处理30分钟，离心，将上清液迅速移入装有lg无水硫酸钠的具塞锥形瓶中，放置30分钟； 随后精密量取上述溶液60mL减压浓缩至近干，并加入体积比为1 :1的环已烷-乙酸乙酯溶 液溶解样品并定容至l〇mL，过滤后取滤液经GPC凝胶渗透色谱净化，以体积比为1 :1的环 已烷-乙酸乙酯溶液为流动相洗脱，收集洗脱液，移入KD瓶中，减压浓缩至近干； 向上述样品中加入体积比为1 :1的乙酸乙酯-丙酮混合溶液5mL溶解，并转移至石墨 碳-氨基混合固相萃取小柱上，以体积比为1 :1的乙酸乙酯-丙酮混合溶液15mL洗脱，收集 洗脱液，氮吹至近干，随后加入所述内标贮备液5yL，加乙腈定容至lmL，作为供试品溶液； (3)精密量取上述各浓度混合对照品溶液及供试品溶液各400 y L，并分别加入所述分 析保护剂1〇〇 U L混匀，随后分别精密吸取1 y L，进行气相色谱-质谱联用仪测定；其中， 所述气相色谱分析条件为：取规格为30mX0. 25mmX0. 25um的弹性石英毛细管柱 DB17ms，以高纯氦气为载气，柱流速1. 3mL/分钟，进样量1 y L，采用高压不分流进样，设置 进样口温度为230°C，升温程序具体为：初始温度60°C，以30°C /分钟升至120°C、以10°C / 分钟升至200°C、以2°C /分钟升至230°C、以30°C /分钟升至300°C，并保持7分钟； 所述EI源质谱测定的条件为：设置电子能量70eV，离子源温度230°C，接口温度 250。。。
2. 根据权利要求1所述的大黄药材的检测方法，其特征在于，所述农药残留量检测中， 所述GPC凝胶渗透色谱净化步骤的条件具体为：填料为Bio-Beads S-X3200-400目，净化柱 为2. 5mmX 40cm，具体洗脱参数为净化去杂900s，目标物收集1200s，柱子清洗300s。
3. 根据权利要求1或2所述的大黄药材的检测方法，其特征在于，所述农药残留量检 测中，所述农药对照品包括敌敌畏、甲胺磷、乙酰甲胺磷、四氯硝基苯、六氯苯、六六六、 3 _六六六、六六六、六六六、氧化乐果、二嗪磷、五氯硝基苯、久效磷、地虫硫磷、磷 胺I、乐果、七氯、五氯苯胺、百菌清、甲基毒死蜱、艾氏剂、克菌丹、磷胺II、甲基对硫磷、甲 基嘧啶磷、甲基五氯苯基硫醚、甲霜灵、三唑酮、毒死蜱、马拉硫磷、杀螟硫磷、对硫磷、二甲 戊灵、顺式环氧七氯、反式环氧七氯、三唑醇A、三唑醇B、反式氯丹、顺式硫丹、顺式氯丹、反 式硫丹、PP' _DDE、PP' -DDD、0P' -DDT、PP' -DDT、狄氏剂、杀扑磷、异狄氏剂、乙硫磷、三苯基磷 酸酯、联苯菊酯、硫丹硫酸酯、异菌脲、甲氰菊酯、三氯杀螨醇、氯氟氰菊酯、甲氧DDT、三氯杀 螨砜、伏杀硫磷、氯菊酯1、氯菊酯2、氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯。
4. 根据权利要求1-3任一所述的大黄药材的检测方法，其特征在于，所述没食子酸和 儿茶素的含量测定中，所述供试品制备的超声条件为功率200W，频率40kHz。
5. 根据权利要求1-4任一所述的大黄药材的检测方法，其特征在于，所述农药残留量 检测中，所述待测药材的粒径为180-2000 ii m。
【文档编号】G01N30/02GK104374847SQ201410375520
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年7月31日 优先权日:2014年7月31日
【发明者】李士博, 韩斌, 陈杰, 李登鹏, 李波, 宋平顺, 赵建邦, 何禄仁, 杨锡, 杨静 申请人:甘肃中天药业有限责任公司