一种副猪嗜血杆菌试纸条及其制备方法
【专利摘要】本发明公开一种副猪嗜血杆菌5型胶体金定型试剂盒和试剂盒的制备方法。本发明的试纸条,包括依次连接固定于PVC板上的由吸水材料构成的样品垫、包被有抗原的胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸收垫，以及位于硝酸纤维素膜上且相互分开的检测线和质控线，其中胶体金垫包被的抗原是副猪嗜血杆菌OPPA融合蛋白，检测线是副猪嗜血杆菌5型全菌抗原，质控线是副猪嗜血杆菌全菌抗原的多抗IgG。本发明的试纸条具有特异性好、敏感性强和重复性的优点。
【专利说明】一种副猪嗜血杆菌试纸条及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种畜牧业使用的疾病检测试剂及制备方法，特别是一种副猪嗜血杆菌5型胶体金定型试剂盒,和该试剂盒的制备方法。
【背景技术】
[0002]由于副猪嗜血杆菌血清型较多，目前已知的有15个血清型，用于检测该病原和抗体的方法也较多，但均是种特异性的，副猪嗜血杆菌病的检测方法有检测抗原的PCR方法还有检测血清抗体的间接血凝方法以及ELISA方法，定型检测只有本 申请人:研制的琼扩试验进行，琼扩试验制备复杂，检测需要2-3天才能出结果，且被检血清需要浓缩，对抗原的要求高。副猪嗜血杆菌5型是目前我国副猪嗜血杆菌病的流行的毒株之一，但现有技术中缺少能够定型检测5型血清型抗体，特别是快速检测方法，因此影响田间流行病学的调查和准确进行防治工作。
【发明内容】
[0003]本发明提供一种可克服现有技术不足，能简捷、方便且快速地进行副猪嗜血杆菌5型分型检测的试纸条。
[0004]一种检测副猪嗜血杆菌5型试纸条，包括依次连接固定于PVC板上的由吸水材料构成的样品垫、包被有抗原的胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸收垫，以及位于硝酸纤维素膜上且相互分开的检测线和质控线，其中胶体金垫包被的抗原是副猪嗜血杆菌OPPA融合蛋白，检测线是副猪嗜血杆菌5型全菌抗原，质控线是副猪嗜血杆菌全菌抗原的多抗IgG。
[0005]本发明的副猪嗜血杆菌试纸条制备方法是:
a.用副猪嗜血杆菌OPPA融合蛋白包被胶体金，制备出胶体金；
b.在PVC条上依次固定吸水材料构成的样品垫、包被有抗原的胶体金垫、硝酸纤维膜、吸收垫
c.取副猪嗜血杆菌5型全菌抗原，经过超声波破碎，反复冻融之后3000转/分钟离心10分钟，取上清在硝酸纤维膜上制备检测线；
d.用得到的副猪嗜血杆菌5型全菌抗原多抗IgG，在硝酸纤维膜上制备检测线；
e.按要求切割得到副猪嗜血杆菌试纸条。
[0006]本发明的副猪嗜血杆菌试纸条制备方法中，抗原结合金标垫的pH值为7.0，且在抗原结合的过程中需要加入18% BSA 50ul/ml、l%PEG 20000 50ul/ml进行封闭，封闭时间为30分钟，经过封闭可减少假阳性的出现，离心后的重悬液其配方为:0.02M四硼酸钠、0.5% BSA,5%蔗糖、0.05%吐温20，重悬后铺金，37°C干燥I小时。然后进行试纸条的组装。
[0007]本发明的副猪嗜血杆菌试纸条所用的制备方法中，副猪嗜血杆菌OPPA融合蛋白是以副猪嗜血杆菌DNA 为模板，以 5' -GGCGAATTCATGCAAACAACCTTTACC-3' (SEQ ID N0.1)和 5' -CCCTCGAGTTACTGCTTAATGATATA-3' (SEQ ID No2).为引物进行 PCR 扩增，将经纯化的PCR产物连接入pMD18-T simple vector，再按常规方法转化DH5 α感受态细，经酶切后阳性重组质粒命名为为pMD-OppA，分别用I和通ο I双酶切重组质粒pMD-OppA与pET-30a-c (+)载体，酶切后经琼脂糖凝胶电泳，切下所需的目的条带，回收纯化目的片段和载体片段，用T4 Iigase连接，再将连接产物转化到DH5a大肠杆菌感受态细胞中得到阳性重组质粒命名为pET-30a-0ppA，再将重组表达质粒pET-30a-0ppA转化大肠杆菌BL21得到DE3-HPS-0ppA工程菌种，DE3-HPS_0ppA工程菌诱导表达后层析柱纯化后得到。
[0008]本发明的试纸条具有特异性好、敏感性强和重复性的优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1为本发明的试纸条示意图，图中:IPVC板，2硝酸纤维素膜，3吸收垫，4金标垫，5样品垫，6质控线，7检测线，
图2为纯化的OppA重组蛋白SDS-PAGE电泳图，其中:M.蛋白分子质量标准；1泳道为纯化前蛋白；2.泳道为纯化后的蛋白。
[0010]图3为本发明的试纸条对标准阳性血清和阴性血清检测结果图，其中:1为阳性血清；2为阴性血清。
[0011]图4为本发明试纸条检测田间血清阳性结果图和阴性对照，其中:1-7为试纸条检测田间血清阳性结果；8为阴性对照。
[0012]图5为本发明试纸条特异性结果图，其中:1)对副猪嗜血杆菌5型血清；2)猪传胸血清；3)猪肺炎支原体血清；4)巴氏杆菌阳性血清。由图可见本发明的试纸条仅对副猪嗜血杆菌5型血清显阳性，而对其它的血清均为阴性。
[0013]图6试纸条检测15个血清型结果图，由图可知其中只有5型(左边第一条试纸)为阳性结果，其他血清型为阴性结果。
【具体实施方式】
[0014]本发明以下结合实施例解说。
[0015]本发明的试纸条中使用的金标垫包被的抗原为副猪嗜血杆菌OPPA融合蛋白。本发明的金标垫包被的抗原为副猪嗜血杆菌OPPA融合蛋白，该蛋白是副猪嗜血杆菌15个血清型中共有的特异性蛋白，经过体外获得序列，进行了序列优化，加入了融合标签，然后克隆、表达的蛋白，表达之后经过一系列的纯化，然后运用于该试纸条，其目的是提高了检测试纸条的特异性。其制备方法如下:
I引物设计及酶切位点的选择
根据 GenBank 中 HPS OppA 基因序列(SH0165 株登录号:NC_011852.1),应用 Primer
5.0设计I对特异性引物，上、下游引物分别引入I和通ο I酶切位点(下划线部分)，引物如下:
上游引物 OppA-F:5' -GGCGAATTCATGCAAACAACCTTTACC-3' (SEQ ID N0.1)；
下游引物 OppA-R:5' -CCCTCGAGTTACTGCTTAATGATATA-3' (SEQ ID N0.2)。
[0016]扩增片段长度为1638 bp。
[0017]2 OppA基因的克隆
副猪嗜血杆菌5型(HPS 5型)抗原系中国农业科学院兰州兽医研究所保存，经过划线培养接种摇菌瓶到一定量，将培养的HPS提取DNA，使用0ppA-F/0ppA-R引物进行PCR，PCR条件为:94°C 变性5 min后，以94°C 50 s、51°C 45 s ,72°C 2 min循环35次，最后72°C延伸10min，PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测后，用干净的刀片快速切下含有目的片段的琼脂糖凝胶，按Agarose Gel DNA Extract1nKit (Axygen)说明书操作进行回收纯化。按照pMD18_T simple vector kit (TaKaRa)操作说明书，将纯化的PCR产物连接入pMD18-T simple vector, 16 1:连接过夜。按常规方法转化DH5ci感受态细胞后挑选阳性克隆(《分子克隆》第二版，中国科学出版社)。经酶切和测序鉴定正确的阳性重组质粒命名为为pMD-OppA。
[0018]3 OppA表达工程菌构建
3.1重组表达载体pET-30a-0ppA的构建
分别用I和通ο I双酶切重组质粒pMD-OppA与pET-30a-c (+)载体，使其产生相同的粘性末端。酶切后经10 g/L琼脂糖凝胶电泳，切下所需的目的条带，用Agarose GelDNA Extract1n Kit (Axygen)回收纯化目的片段和载体片段,用T4 ligase (TaKaRa)过夜连接，将连接产物转化到DH5 α大肠杆菌感受态细胞中，经酶切和测序鉴定正确的阳性重组质粒命名为pET-30a-0ppA。
[0019]3.2重组表达质粒pET-30a_0ppA转化大肠杆菌BL21 (DE3)
重组质粒pET-30a-0ppA按常规方法转化BL21 (DE3)感受态细胞(《分子克隆》第二版，中国科学出版社)，转化菌涂布于LB平板(5(^g/mL Kan+)，37°C过夜培养。挑取单菌落接入5mL LB培养液(5(^g/mL，Kan+)中，37°C，220r/min振荡培养过夜。经酶切和PCR鉴定正确。含表达重组质粒pET-30a-0ppA，并能表达OppA重组蛋白的大肠杆菌BL21(DE3)命名为DE3-HPS-0ppA 工程菌种。
[0020]3.3 DE3-HPS-0ppA工程菌诱导表达及产物鉴定
(I) DE3-HPS-0ppA工程菌种的试表达和表达产物的SDS-PAGE鉴定挑取LB平板(5(^g/mL Kan+)上单菌落培养鉴定筛选OppA表达工程菌。接种3 ml LB液体培养基(5(^g/mL Kan+)，37°C，220r/min振荡培养过夜。取Iml上述过夜培养物接种于新鲜的10ml含LB液体培养基(5(^g/mL Kan+), 37°C，220r/min振荡培养3h左右，至OD6tltl为0.5，在37。。，IPTG浓度为0.1 mmol/L，诱导6h时，表达产物进行SDS-PAGE鉴定。
[0021](2) OppA表达条件的优化
经12%的SDS-PAGE凝胶鉴定确定最佳表达条件。DE3-HPS_0ppA工程菌种在16°C低温诱导可产生大量可溶性蛋白，IPTG浓度0.0lmmol/L为最佳诱导浓度，16小时为最佳诱导时间。
[0022](3)亲和层析柱纯化OppA重组蛋白
用镍离子亲和层析方法纯化OppA重组蛋白。先将8 mL N1-NTA His Bind Resin (南京金斯瑞)装入空层析柱，让液体靠重力作用自然滴出后，层析柱用10倍NTA体积的平衡Buffer洗涤，然后将样品加到层析柱中，冰上结合30分钟然后让其流出；层析柱用5倍平衡Buffer洗涤，最后用5倍NTA体积的NTA-60洗脱Buffer进行洗脱，收集洗脱液，得到纯化后蛋白，其检测的电泳图见图2。
[0023]用上述方法得到的纯化OppA重组蛋白包被胶体金并制备胶体金垫，抗原结合金标垫的pH值为7.0，且在抗原结合的过程中需要加入18% BSA 50ul/mlU%PEG 2000050ul/ml进行封闭，封闭时间为30分钟，离心后的重悬液其配方为:0.02M四硼酸钠、0.5%BSA、5%蔗糖、0.05%吐温20。重悬后铺金，37°C干燥I小时。然后进行试纸条的组装。
[0024]本发明的检测线是运用副猪嗜血杆菌5型全菌抗原，本发明的副猪嗜血杆菌5型菌取自中国农业科学院兰州兽医研究所。全菌抗原的制备方法是:
将甘油冻存的副猪嗜血杆菌5型接种于含5%马血清的TSA平板上，置37°C二氧化碳培养箱培养18小时后，挑取单个菌落接种于含5%马血清的TSB培养基中，置37°C恒温摇床培养12-16小时，以同样方法扩大培养，收集菌液，以3500转/分钟离心10分钟，弃上清，收集沉淀，用PH7.2的PBS洗涤2次，然后用少量相同的PBS重悬，超声破碎，经过超声波破碎，反复冻融之后3000转/分钟离心10分钟，取上清，定量后用于制备检测线。
[0025]质控线是运用的副猪嗜血杆菌5型全菌抗原的多抗IgG，该IgG是用高免血清经过纯化而得，副猪嗜血杆菌5型高免血清的制备方法如下:
I选用2kg左右、12月龄的健康雄性家兔。菌种用副猪嗜血杆菌5型标准株。
[0026]2免疫原的制备
2.1灭活抗原制备将甘油冻存的副猪嗜血杆菌接种于含5%马血清的TSA平板上，置37°C二氧化碳培养箱培养18小时后，挑取单个菌落接种于含5%马血清的TSB培养基中，置37°C恒温摇床培养12-16小时，以同样方法扩大培养，收集菌液，浓缩，培养物滴度达108CFU/mL,经检验合格后，加入40%甲醛溶液，使其终浓度0.2%进行灭活，灭活抗原抽样接种TSA培养基，37°C培养24小时，无细菌生长为合格。合格抗原在4°C条件下用PBS(0.15M，pH为6.4)离心洗涤3次，用紫外分光光度计测定蛋白浓度后，将抗原稀释至10mg/mL备用。
[0027]2.2活抗原制备取将5型副猪嗜血杆菌单克隆接种到TSA培养平板上，置37°C二氧化碳培养箱培养16-18小时，在超净台用PBS (0.15M, pH为7.2)洗平皿，将洗下的菌体测定浓度，制成109CFU/mL浓缩抗原备用。
[0028]5弗氏完全佐剂抗原和弗氏不完全佐剂抗原的配制
弗氏完全佐剂抗原:弗氏油佐剂3mL加卡介苗60mg加抗原3mL。
[0029]弗氏不完全佐剂抗原:弗氏油佐剂3mL加抗原3mL。
[0030]上述佐剂抗原均在免疫接种前配制，并充分混合乳化。
[0031]3免疫程序取上述充分乳化的弗氏完全佐剂抗原，于每只兔两后腿足部皮下，胭淋巴结处及背部皮下多点接种，接种总量为1.5mL，21日后仍以上述抗原和剂量由背部皮下多点接种，进行第二次免疫；隔11日后，以上述弗氏不完全佐剂抗原，由每只兔肩部肌肉两点，背部皮下多点接种，接种总量为3mL，为其第三次免疫；11日后，取活抗原由每只兔耳静脉注射lmL，以加强免疫。
[0032]4试血隔14日后由耳缘静脉采血分离血清，以IHA试验试血，若免疫兔血清IHA效价达1:128或以上，则正式采血。如免疫兔血清效价偏低，可按第三次的剂量和免疫途径再进行一次加强免疫，隔7?14日再进行试血，如免疫兔血清效价达到要求，可按前述方法制备高免血清。否则弃之。
[0033]5采血将血清效价合格的兔无菌分别由颈动脉放血。
[0034]6提取血清用自然凝结法无菌分离血清。
[0035]分离到血清用硫酸铵沉淀法纯化得到的IgG用于制备质控线。
[0036]试纸条组装操作按如下步骤进行在PVC背衬板I上由上至下分别将样品垫5、胶体金垫4，包括检测线7和质控线6的硝酸纤维素膜2以及吸收垫3按顺序装配，将PVC衬板I设在最底部，衬板I上部中段设有硝酸纤维素膜2，硝酸纤维素膜2上部左端贴有吸收垫3，硝酸纤维素膜2上部右端设有金标垫4，金标垫4的上部右端设有样品垫5，再分别用喷枪将前述得到的红纯化的副猪嗜血杆菌5型全菌抗原和IgG在硝酸纤维素膜2上制出检测线和质控线，在本发明中检测线与质控线两线间距离保持在0.Smm0再将试纸切割成4_宽的条状，即制成如附图1的结构本发明的副猪嗜血杆菌5型胶体金定型检测试纸条。
[0037]本发明的试纸条分别对阳性血清和阴性血清进行检测，结果见附图3，由附图3可见，阳性显示检测线和质控线均为红色，阴性检测线和质控线两线均不变色。
[0038]对田间样品检测的结果见附图4，同样，阳性样品的检测线和质控线均为红色，而第八个阴性样品的两线均不显示。
[0039]经对副猪嗜血杆菌5型血清、猪传胸血清、猪肺炎支原体血清和巴氏杆菌阳性血清进行检测的结果见附图5，从中可见只有副猪嗜血杆菌5型血清的第一个样品显示出两条红线，其余三个样品均未发生反应。
[0040]经对副猪嗜血杆菌15个标准血清型高免血清进行检测结果图6，只有5型血清有阳性结果，其余均为阴性。
[0041]运用琼脂糖扩散试验与本发明的试纸检测进行了对比，进行分型血清检测同样OPPA蛋白高免的血清可达到1:32，而运用本发明的试纸条可达到1:1024，敏感性明显高于琼脂糖扩散试验。
【权利要求】
1.一种检测副猪嗜血杆菌5型试纸条，包括依次连接固定于PVC板上的由吸水材料构成的样品垫、包被有抗原的胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸收垫，以及位于硝酸纤维素膜上且相互分开的检测线和质控线，其特征在于胶体金垫包被的抗原是副猪嗜血杆菌OPPA融合蛋白，检测线是副猪嗜血杆菌5型全菌抗原，质控线是副猪嗜血杆菌全菌抗原的多抗IgG。
2.权利要求1所述的副猪嗜血杆菌试纸条制备方法，其特征在于: a.用副猪嗜血杆菌OPPA融合蛋白包被胶体金，制备出胶体金； b.在PVC条上依次固定吸水材料构成的样品垫、包被有抗原的胶体金垫、硝酸纤维膜、吸收垫 c.取副猪嗜血杆菌5型全菌抗原，经过超声波破碎，反复冻融之后3000转/分钟离心10分钟，取上清在硝酸纤维膜上制备检测线； d，用得到的副猪嗜血杆菌5型全菌抗原多抗IgG，在硝酸纤维膜上制备检测线； e.按要求切割得到副猪嗜血杆菌试纸条。
3.根据权利要求2所述的副猪嗜血杆菌试纸条制备方法，其特征在于抗原结合金标垫的pH值为7.0，且在抗原结合的过程中需要加入18% BSA 50ul/ml、l%PEG 20000 50ul/ml进行封闭，封闭时间为30分钟，离心后的重悬液其配方为:0.02M四硼酸钠、0.5% BSA、5%蔗糖、0.05%吐温20，重悬后铺金，37°C干燥I小时，然后进行试纸条的组装。
4.权利要求2或3所述的副猪嗜血杆菌试纸条所用的制备方法，其特征在于副猪嗜血杆菌OPPA融合蛋白是以副猪嗜血杆菌DNA为模板，以SEQ ID Ns I和SEQ ID Ns 2为引物进行PCR扩增，将经纯化的PCR产物连接入pMD18-T simple vector，再按常规方法转化DH5 α感受态细，经酶切后阳性重组质粒命名为为pMD-OppA，分别用I和ZAo I双酶切重组质粒pMD-OppA与pET-30a-c (+)载体,酶切后经琼脂糖凝胶电泳，切下所需的目的条带，回收纯化目的片段和载体片段，用T4 Iigase连接，再将连接产物转化到DH5CI大肠杆菌感受态细胞中得到阳性重组质粒命名为pET-30a-0ppA，再将重组表达质粒pET-30a_0ppA转化大肠杆菌BL21得到DE3-HPS-0ppA工程菌种，DE3-HPS_0ppA工程菌诱导表达后层析柱纯化后得到副猪嗜血杆菌OPPA融合蛋白。
【文档编号】G01N33/569GK104251905SQ201410437671
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2014年9月1日 优先权日:2014年9月1日
【发明者】贺英, 逯忠新, 赵萍, 储岳峰, 陈胜利, 张建军 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所