鸟苷发酵过程红外指纹图谱的构建方法
【专利摘要】本发明涉及鸟苷发酵过程红外指纹图谱的构建方法，属于生物发酵检测【技术领域】。该方法包括鸟苷发酵液样品采集和制备、光谱采集、鸟苷发酵液红外吸收特征峰位置的确定、鸟苷发酵前、中、后期指纹图谱的构建和指纹图谱的验证五大步骤。通过本发明构建鸟苷发酵不同时间段的红外指纹图谱，实现了利用红外指纹图谱方便快捷的监控鸟苷发酵过程，建立红外指纹图谱监测鸟苷发酵过程的新方法，为生物发酵过程的优化控制开辟更为便捷的新途径。
【专利说明】鸟苷发酵过程红外指纹图谱的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物发酵检测【技术领域】，具体涉及鸟苷发酵过程红外指纹图谱的构建方法。
【背景技术】
[0002]指纹图谱是法医学上的一个概念，最早来源于19世纪末、20世纪初的犯罪学和法医学。由于指纹具有人各不同，终生不变，触物留痕，可以认定人身的特点，指纹鉴定结论在侦察和审判中起着重要作用，被称为“物证之首”、“证据之王”。红外指纹图谱鉴别技术将光谱测量技术、计算机技术、化学计量学技术与基础测试技术有机结合，参照已知产品的组成或性质的信息，采用化学计量学技术提取出样品红外光谱的指纹特征，确定样品的特征指纹图谱或进一步建立判定模型，从而通过图谱比较或模型识别实现样品的鉴别或进一步判断待测样品是否合格的一种分析方法。该技术结合了指纹图谱概念和红外光谱分析技术，分析范围几乎可覆盖所有的有机化合物和混合物。这一技术具有样品无损、制样检测快速、准确、重复性好等优点，在几分钟内即可完成样品的检测。与常规的化学方法分析发酵液成分相比较，具有快速简便的特点，可同时监测培养过程中多组分浓度的变化，优化培养基的组成和发酵过程的进程。
[0003]目前，红外指纹图谱在中药质控领域卓见成效，它可准确且又可量化地对药材进行真伪鉴别和质量评价。清华大学分析中心在红外指纹图谱质控中药领域的成绩斐然，该中心已经先后测试了 280种对照药材，20种伪品药材，4种不同产地的药材，400多种中药配方颗粒等，获得共计2000多张红外光谱、二阶导数谱和几百张二维相关红外谱。孙素琴等所著《中药二维相关红外光谱鉴定图集》一书在国外也产生了非常大的影响，已传入美国、英国、新加坡、马来西亚等国。另外，红外指纹图谱在饲料添加剂和食品应用也引起了越来越多的重视。中科院饲料所张萍研究员带领的研究团队成功开发出饲料添加剂产品红外指纹图谱鉴别技术。2007年，北京市食品安全监控中心与清华大学开展红外指纹图谱等前沿技术在食品安全监控中的应用研究，将“红外指纹”图谱技术正式应用到食品安全监控中。红外指纹图谱在中药、食品、饲料添加剂领域的应用，开辟了相应领域质量监控技术的新篇.1V.早。
[0004]20世纪90年代以来，红外光谱分析技术在发酵液检测方面的应用得到越来越多的关注。Zeaiter等利用近红外检测葡萄酒发酵过程中温度变化产生的影响，Georgina等利用近红外与偏最小二乘法相结合监测啤酒发酵过程的生物量和化学变化。彭帮柱等采用分阶段处理结合人工神经网络法对不同发酵阶段的糖度检测。邱江等用偏最小二乘法建立了培养液的红外光谱数据与常规离线化学分析结果的相关关系，成功地用于糖化酶发酵过程培养液中总糖、还原糖和氨氮的预测。陈雷等用声光可调(AOTF)-近红外(NIR)光谱技术对发酵液中发酵菌的含量进行检测。刘贤等采用近红外光谱技术，结合偏最小二乘回归法，研究了 142个不同种类的秸杆青贮饲料样品的pH值和发酵产物(乳酸、乙酸、丙酸、丁酸和氨态氮)。张梦霖等利用近红外光谱技术对废水厌氧发酵处理过程进行分析监测，建立了厌氧发酵过程中蔗糖和挥发性脂肪酸浓度的预测模型、实现了准确地测定厌氧发酵过程中液相中各组分的浓度变化，为厌氧发酵过程的在线监测提供了新的思路。国内外红外光谱技术在发酵过程检测中的研究，为本课题顺利开展提供思想和技术方法上的有利支撑。
[0005]鸟苷发酵过程是一个实时、非线性、多变量输入输出和随机性的动态过程，发酵过程中发酵液组成复杂，组分和含量具有时变性，至今为止鸟苷发酵过程的监测控制主要依赖操作繁琐、费时费力的化学分析检测。如何快捷检测鸟苷发酵过程，了解鸟苷发酵的动态，优化控制鸟苷发酵过程，一直以来是鸟苷发酵工作者研究的主要领域。红外光谱分析技术是一门发展迅猛的高新技术，不仅广泛应用于化学组成和结构的定性定量鉴别，而且在发酵过程的检测中日益显示出特有的优势。许多发酵过程都尝试着使用红外光谱分析技术进行检测。但是，目前红外光谱技术在发酵领域的使用多为发酵液中某一和几个组分的检测，很难真正意义上监测控制生物发酵过程，因此如何克服现有技术的不足是目前分析化学【技术领域】亟需解决的问题。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供鸟苷发酵过程红外指纹图谱的构建方法。
[0007]本发明构建鸟苷发酵不同时间段的红外指纹图谱，实现利用红外指纹图谱方便快捷的监控鸟苷发酵过程，建立红外指纹图谱监测鸟苷发酵过程的新方法，为生物发酵过程的优化控制开辟更为便捷的新途径。
[0008]本发明采用的技术方案如下:
[0009]鸟苷发酵过程红外指纹图谱的构建方法，包括如下步骤:
[0010]步骤(I)，发酵液样品采集和制备:
[0011]I)菌种活化
[0012]取平板上的单菌落划线接种于活化斜面，36_38°C恒温静置培养12_14h ；
[0013]2)种子培养
[0014]接两环生长良好的活化斜面菌种放入装有种子培养基的摇瓶中，纱布封口，置于往复式摇床上，36-37°C振荡培养12-18h，得到种子液；
[0015]3)鸟苷发酵
[0016]将上述种子液以10%的接种量接入装有发酵培养基的三角瓶中，置于往复式摇床上或发酵罐中，36-37 °C，培养72h，获得发酵液；
[0017]4)采集
[0018]将10批次的鸟苷发酵每隔9h从三个平行样品中分别采集3份发酵液样品，其中0-27h所采样品为发酵前期样品、27-45h的样品为发酵中期样品，45-72h的样品为发酵后期样品；
[0019]步骤(2)，发酵液鸟苷含量的测定:
[0020]发酵液中鸟苷含量采用常用的高效液相色谱法定量测定；
[0021]步骤(3)，光谱采集:
[0022]利用红外光谱仪采集光谱，以空气为参比，对步骤(I)得到的发酵前、中、后期样品的发酵液分别重复扫描次数5次，取平均光谱；
[0023]步骤(4)，鸟苷发酵液红外吸收特征峰位置的确定:
[0024]利用纯水、鸟苷标准品及发酵上层清液为对照，确定发酵液红外特征峰的位置；
[0025]步骤(5)，鸟苷发酵前、中、后期指纹图谱的构建:
[0026]以鸟苷发酵液特征峰为主要研究对象，根据步骤(2)测定的发酵液中的鸟苷含量，研究鸟苷发酵前、中、后期红外吸收图谱特征，构建指纹图谱；
[0027]步骤(6)，指纹图谱的验证:
[0028]10批次摇床及5批次发酵罐验证指纹图谱可靠性。
[0029]本发明技术方案中步骤(I)中所述的种子培养时，接两环生长良好的活化斜面菌种放入装有15mL种子培养基的250mL摇瓶中。
[0030]本发明技术方案中步骤(I)中种子培养时，纱布封口的纱布层数为8层。
[0031]本发明技术方案中步骤(I)中种子培养和鸟苷发酵时，往复式摇床的冲程76mm，速度为108r/min。
[0032]本发明技术方案中步骤(I)中鸟苷发酵时，将上述种子液以10%的接种量接入装有20ml发酵培养基的500ml三角瓶中。
[0033]本发明技术方案中步骤(I)中10批次为往复式摇床和发酵罐发酵各5批。
[0034]本发明技术方案中所述的发酵罐发酵的发酵罐为10L，发酵条件为温度36°C，转速600转/分，ρΗ6.5，填料系数0.7，溶氧30-40%。
[0035]本发明技术方案中所述的红外光谱仪为德国BRUKER Tensor 27红外光谱仪。
[0036]本发明技术方案中所述的红外光谱的波长范围为4000-600CHT1。
[0037]本发明技术方案中所述的鸟苷发酵每隔9h从三个平行样品中分别采集Iml的3份发酵液样品。
[0038]本发明技术方案中所述的发酵上层清液为相应的发酵液离心后所得。
[0039]本发明与现有技术相比，其有益效果为:本发明构建鸟苷发酵不同时间段的红外指纹图谱，实现利用红外指纹图谱方便快捷的监控鸟苷发酵过程，建立红外指纹图谱监测鸟苷发酵过程的新方法，为生物发酵过程的优化控制开辟更为便捷的新途径；(2)本发明构建的红外指纹图谱对于鸟苷产量测定具有重要的意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0040]图1是纯水、发酵64h发酵液、发酵64h发酵液的上清液红外吸收光谱；
[0041]图2是鸟苷标准品的红外吸收光谱图；
[0042]图3是发酵0_27h发酵液红外吸收光谱比较图；
[0043]图4是发酵27_45h发酵液红外吸收光谱比较图；
[0044]图5是发酵45_72h发酵液红外吸收光谱比较图。
【具体实施方式】
[0045]下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
[0046]本发明实施例采用的材料、仪器、试剂和培养基的具体说明如下:
[0047]1.1 材料
[0048]鸟苷产生菌(Bacillus subtilis)(保存于河南科技学院发酵工程实验室)
[0049]1.2 仪器
[0050]
TENSOR 27型红外光谱仪德国BRUKER
生化培养箱(SPX-250)上海跃进医疗器械厂
[0051]
落地往复摇床太仓市科教器材厂
台式高速离心机上海安亭科学仪器厂
电子天平上海精科天平
精密天平上海精科天平
隔水式电热恒温培养箱上海跃进医疗器械厂
三角瓶、移液管、培养皿、量筒天津玻璃器械厂
SW-CJ-2FD型单人双面超净工作台苏州净化设备有限公司
HVE-50高压灭菌锅日本
电热恒温鼓风干燥箱上海跃进医疗器械厂
电热恒温水温箱北京永光明医疗仪器厂
[0052]1.3主要试剂
[0053]鸟苷标准品中科院上海生化所东风生化技术公司
[0054]1.4培养基
[0055](I)斜面和平板培养基(质量百分数)
[0056]葡萄糖0.5，酵母膏1，蛋白胨1，L-谷氨酸钠0.5，NaCl 0.5，琼脂2.0，余量为去离子水，pH 7.0 ;灭菌条件:121°C，20min。
[0057](2)种子培养基(质量百分数)
[0058]葡萄糖2，酵母膏I，蛋白胨I，玉米浆I，L-谷氨酸钠0.25，NaCl 0.25，尿素0.2，余量为去离子水，pH 7.0。灭菌条件:118°C,20min。
[0059](3)发酵培养基(质量百分数)
[0060]葡萄糖12，酵母粉 1.6，L-谷氨酸钠 1，(NH4)2SO4 1.5，KH2PO4 0.2，MgSO4 0.4，CaCO3 2，豆饼水解液5ml/100ml，余量为去离子水，pH 7.0。灭菌条件:除CaCO3外，其余的为115°C，15min。CaCO3的灭菌条件为121°C，20min，接种前加入。
[0061]实施例1
[0062]鸟苷发酵过程红外指纹图谱的构建方法，包括如下步骤:
[0063]步骤(I)，发酵液样品采集和制备:
[0064]I)菌种活化
[0065]取平板上的单菌落划线接种于活化斜面，36°C恒温静置培养12h ；
[0066]2)种子培养
[0067]接两环生长良好的活化斜面菌种放入装有15mL种子培养基的250mL摇瓶中，8层纱布封口，置于往复式摇床上，冲程76mm，速度为108r/min，36°C振荡培养12h，得到种子液；
[0068]3)鸟苷发酵
[0069]将上述种子液以10%的接种量接入装有20ml发酵培养基的500ml三角瓶中，置于往复式摇床上，冲程76mm，速度为108r/min，36°C，培养72h，获得发酵液；
[0070]4)采集
[0071]将10批次往复式摇床发酵的鸟苷发酵每隔9h从三个平行样品中分别采集Iml的3份发酵液样品，其中0-27h所采样品为发酵前期样品、27-45h的样品为发酵中期样品，45-72h的样品为发酵后期样品；
[0072]步骤(2)，发酵液鸟苷含量的测定:
[0073]发酵液中鸟苷含量采用目前工厂常用的高效液相色谱法定量测定；
[0074]步骤(3)，光谱采集:
[0075]利用德国BRUKER Tensor 27红外光谱仪采集光谱，以空气为参比，对步骤(I)得到的发酵前、中、后期样品的发酵液及其上层清液分别重复扫描次数5次，取平均光谱；其中，红外光谱的波长范围为4000-600(^1'
[0076]步骤(4)，鸟苷发酵液红外吸收特征峰位置的确定:
[0077]利用纯水、鸟苷标准品及发酵上层清液为对照，确定发酵液红外特征峰的位置；
[0078]步骤(5)，鸟苷发酵前、中、后期指纹图谱的构建:
[0079]以鸟苷发酵液特征峰为主要研究对象，根据步骤(2)测定的发酵液中的鸟苷含量，研究鸟苷发酵前、中、后期红外吸收图谱特征，构建指纹图谱；
[0080]步骤(6)，指纹图谱的验证:
[0081]10批次摇床及5批次发酵罐验证指纹图谱可靠性。其中，发酵罐发酵的发酵罐为10L，发酵条件为温度36°C，转速600转/分，pH6.5，填料系数0.7，溶氧30-40%。
[0082]实施例2
[0083]鸟苷发酵过程红外指纹图谱的构建方法，包括如下步骤:
[0084]步骤⑴，发酵液样品采集和制备:
[0085]I)菌种活化
[0086]取平板上的单菌落划线接种于活化斜面，38°C恒温静置培养14h ；
[0087]2)种子培养
[0088]接两环生长良好的活化斜面菌种放入装有15mL种子培养基的250mL摇瓶中，8层纱布封口，置于往复式摇床上，往复式摇床的冲程76mm，速度为108r/min，37°C振荡培养18h，得到种子液；
[0089]3)鸟苷发酵
[0090]将上述种子液以10%的接种量接入装有20ml发酵培养基的500ml三角瓶中，置于发酵罐中，37°C，培养72h，获得发酵液；
[0091]4)采集
[0092]将10批次发酵罐发酵的鸟苷发酵每隔9h从三个平行样品中分别采集Iml的3份发酵液样品，其中0-27h所采样品为发酵前期样品、27-45h的样品为发酵中期样品，45-72h的样品为发酵后期样品；
[0093]步骤(2)，发酵液鸟苷含量的测定:
[0094]发酵液中鸟苷含量采用目前工厂常用的高效液相色谱法定量测定；
[0095]步骤(3)，光谱采集:
[0096]利用德国BRUKER Tensor 27红外光谱仪采集光谱，以空气为参比，对步骤(I)得到的发酵前、中、后期样品的发酵液及其上层清液分别重复扫描次数5次，取平均光谱；其中，红外光谱的波长范围为4000-600(^1'
[0097]步骤(4)，鸟苷发酵液红外吸收特征峰位置的确定:
[0098]利用纯水、鸟苷标准品及发酵上层清液为对照，确定发酵液红外特征峰的位置；
[0099]步骤(5)，鸟苷发酵前、中、后期指纹图谱的构建:
[0100]以鸟苷发酵液特征峰为主要研究对象，根据步骤(2)测定的发酵液中的鸟苷含量，研究鸟苷发酵前、中、后期红外吸收图谱特征，构建指纹图谱；
[0101]步骤(6)，指纹图谱的验证:
[0102]10批次摇床及5批次发酵罐验证指纹图谱可靠性。
[0103]其中，发酵罐发酵的发酵罐为10L，发酵条件为温度36°C，转速600转/分，pH6.5，填料系数0.7，溶氧30-40
[0104]实施例3
[0105]鸟苷发酵过程红外指纹图谱的构建方法，包括如下步骤:
[0106]步骤(I)，发酵液样品采集和制备:
[0107]I)菌种活化
[0108]取平板上的单菌落划线接种于活化斜面，37°C恒温静置培养13h ；
[0109]2)种子培养
[0110]接两环生长良好的活化斜面菌种放入装有15mL种子培养基的250mL摇瓶中，8层纱布封口，置于往复式摇床上，往复式摇床的冲程76mm，速度为108r/min，36.5°C振荡培养16h，得到种子液；
[0111]3)鸟苷发酵
[0112]将上述种子液以10%的接种量接入装有20ml发酵培养基的500ml三角瓶中，置于往复式摇床上或发酵罐中，36.7°C，培养72h，获得发酵液；
[0113]4)采集
[0114]将10批次的鸟苷发酵每隔9h从三个平行样品中分别采集Iml的3份发酵液样品，其中0-27h所采样品为发酵前期样品、27-45h的样品为发酵中期样品，45-72h的样品为发酵后期样品；10批次的鸟苷发酵为往复式摇床和发酵罐发酵各5批；所述的发酵罐发酵的发酵罐为10L，发酵条件为温度36 °C，转速600转/分，pH6.5，填料系数0.7，溶氧30-40%;鸟苷发酵时，往复式摇床的冲程76mm,速度为108r/min ；
[0115]步骤(2)，发酵液鸟苷含量的测定:
[0116]发酵液中鸟苷含量采用目前工厂常用的高效液相色谱法定量测定；
[0117]步骤(3)，光谱采集:
[0118]利用德国BRUKER Tensor 27红外光谱仪采集光谱，以空气为参比，对步骤⑴得到的发酵前、中、后期样品的发酵液及其上层清液分别重复扫描次数5次，取平均光谱；其中，红外光谱的波长范围为4000-6000^1 ；
[0119]步骤(4)，鸟苷发酵液红外吸收特征峰位置的确定:
[0120]利用纯水、鸟苷标准品及发酵上层清液为对照，确定发酵液红外特征峰的位置；
[0121]纯水、发酵64h发酵液、发酵64h发酵液的上清液红外吸收光谱见图1，鸟苷标准品的红外吸收光谱见图2。
[0122]鸟苷的结构式为，如下所示。
[0123]
O
JL
HM
I ]L ?>
Z ^ KS-N
H3-N H
mcBz
门
HO OH
[0124]鸟苷中有0-H、C = O、C = N、C_N、N_H、C = C、C-0等基团，这些基团的吸收峰的位置不同。图1中第一个峰在3300-3200(^'纯水、发酵液、发酵上清液在此位置均有强吸收峰，且峰形较宽，符合缔合O-H基团的吸收峰；第二个峰在2300CHT1左右，图2中鸟苷标准品无此峰，比较发酵液和发酵上清液可以得出，此峰是发酵液中可以离心除去的成分的吸收所致，并不是鸟苷发酵液的特征吸收峰；第三个峰在ieOOcnf1左右，比较发现纯水、发酵液、发酵上清液在此位置均有峰，应属于O-H的吸收峰。第四个峰在HOOcnf1左右，只有发酵液在此位置有吸收峰，发酵上清液在此位置没有吸收峰，判断也是发酵液中可以离心除去的成分的吸收所致。第五个峰在llOO-lOOOcnf1，符合C-O(醇、醚等)的吸收范围(UOO-lOOOcnf1)，发酵液、发酵上清液和鸟苷标准品在此均有吸收，C-N的吸收峰在1310-1020(^1'也在此峰附近，在鸟苷中存在较多的C-O和C-N，判断此位置就是要研究的重点位置。
[0125]从图1可以看出要研究的吸收位置峰形并不尖锐，而是比较平缓，可能是由于发酵液成分非常复杂，各种组分干扰所致，所以只能大概从峰形的变化上来研究。
[0126]步骤(5)，鸟苷发酵前、中、后期指纹图谱的构建:
[0127]以鸟苷发酵液特征峰为主要研究对象，根据步骤(2)测定的发酵液中的鸟苷含量，研究鸟苷发酵前、中、后期红外吸收图谱特征，构建指纹图谱；
[0128]将发酵不同时期的发酵液进行红外光谱扫描，得到发酵不同时期发酵液的红外吸收光谱，由于要研究的波数区段在llOO-lOOcnT1。
[0129]图3为未接种培养基(发酵0h)，发酵9、18、27h发酵液的红外吸收光谱比较图。从图中可以看出，未接种培养基的吸收光谱非常杂乱，峰很多，吸收强度很大，发酵9h的发酵液吸收光谱与之相比，除了吸收强度有所减小外，峰形及位置几乎无变化。随着发酵的继续进行，发酵液的吸收峰逐渐趋向于单一化，吸收强度逐渐变小。
[0130]图4为发酵27、36、45h发酵液的红外吸收光谱比较图。从图中可以发现，峰形及位置变化很小，主要是吸收强度的变化。
[0131]图5为发酵45、54、63、72h发酵液的红外吸收光谱。观察图发现，峰形及位置变化很小，吸收峰的强度增大得也很小。
[0132]鸟苷发酵前期主要是培养基中成分的变化，没有新物质生成或生成量很少。发酵9h的发酵液与培养基相比，只有吸收强度的减少，此时没有鸟苷生成，吸收光谱中呈现的是培养基中某些成分的变化，吸收峰很杂乱。吸收强度减小的原因是培养基中有红外吸收的成分的利用。18-27h培养基继续被利用，鸟苷产生并开始累积，红外图谱中吸收峰变得单一，鸟苷的吸收成为主要因素。27h以后鸟苷积累的越来越多，吸收强度越来越大，到45h后进入发酵的后期，鸟苷产率下降，产量变化不大，吸收峰的强度增大得不明显。所以枯草芽孢杆菌发酵产鸟苷过程中鸟苷产量的变化情况是与发酵液红外吸收光谱扫描的结果是相符的。
[0133]发酵液红外吸收光谱扫描的结果与鸟苷产量变化是相符的。可以初步认为用红外吸收光谱技术检测鸟苷的产量是可行的。本研究为利用红外吸收光谱技术检测发酵过程提供了新思路，为检测鸟苷发酵过程提供一种方便快捷的新手段。
[0134]步骤(6)，指纹图谱的验证:
[0135]10批次摇床及5批次1L发酵罐验证指纹图谱可靠性，见表1。
[0136]表1鸟苷发酵液变化规律与指纹图谱一致程度
[0137]
【权利要求】
1.鸟苷发酵过程红外指纹图谱的构建方法，其特征在于包括如下步骤: 步骤(I)，发酵液样品采集和制备: 1)菌种活化 取平板上的单菌落划线接种于活化斜面，36-38°C恒温静置培养12-14h ； 2)种子培养 接两环生长良好的活化斜面菌种放入装有种子培养基的摇瓶中，纱布封口，置于往复式摇床上，36-37°C振荡培养12-18h，得到种子液； 3)鸟苷发酵 将上述种子液以10 %的接种量接入装有发酵培养基的三角瓶中，置于往复式摇床上或发酵罐中，36-37 °C，培养72h，获得发酵液； 4)米集 将10批次的鸟苷发酵每隔9h从三个平行样品中分别采集3份发酵液样品，其中0-27h所采样品为发酵前期样品、27-45h的样品为发酵中期样品，45-72h的样品为发酵后期样品; 步骤(2)，发酵液鸟苷含量的测定: 发酵液中鸟苷含量采用常用的高效液相色谱法定量测定； 步骤(3)，光谱采集: 利用红外光谱仪采集光谱，以空气为参比，对步骤(I)得到的发酵前、中、后期样品的发酵液分别重复扫描次数5次，取平均光谱； 步骤(4)，鸟苷发酵液红外吸收特征峰位置的确定: 利用纯水、鸟苷标准品及发酵上层清液为对照，确定发酵液红外特征峰的位置； 步骤(5)，鸟苷发酵前、中、后期指纹图谱的构建: 以鸟苷发酵液特征峰为主要研究对象，根据步骤(2)测定的发酵液中的鸟苷含量，研究鸟苷发酵前、中、后期红外吸收图谱特征，构建指纹图谱； 步骤￠)，指纹图谱的验证: 10批次摇床及5批次发酵罐验证指纹图谱可靠性。
2.根据权利要求1所述的鸟苷发酵过程红外指纹图谱的构建方法，其特征在于步骤(I)中所述的种子培养时，接两环生长良好的活化斜面菌种放入装有15mL种子培养基的250mL摇瓶中。
3.根据权利要求1所述的鸟苷发酵过程红外指纹图谱的构建方法，其特征在于步骤(I)中种子培养时，纱布封口的纱布层数为8层。
4.根据权利要求1所述的鸟苷发酵过程红外指纹图谱的构建方法，其特征在于步骤(I)中种子培养和鸟苷发酵时，往复式摇床的冲程76mm,速度为108r/min。
5.根据权利要求1所述的鸟苷发酵过程红外指纹图谱的构建方法，其特征在于步骤(I)中鸟苷发酵时，将上述种子液以10%的接种量接入装有20ml发酵培养基的500ml三角瓶中。
6.根据权利要求1所述的鸟苷发酵过程红外指纹图谱的构建方法，其特征在于步骤(I)中10批次为往复式摇床和发酵罐发酵各5批。
7.根据权利要求1所述的鸟苷发酵过程红外指纹图谱的构建方法，其特征在于所述的发酵罐发酵的发酵罐为10L，发酵条件为温度36°C，转速600转/分，pH6.5，填料系数0.7，溶氧 30-40%。
8.根据权利要求1所述的鸟苷发酵过程红外指纹图谱的构建方法，其特征在于所述的红外光谱仪为德国BRUKER Tensor 27红外光谱仪。
9.根据权利要求1所述的鸟苷发酵过程红外指纹图谱的构建方法，其特征在于所述的红外光谱的波长范围为4000-600(^1'
10.根据权利要求1所述的鸟苷发酵过程红外指纹图谱的构建方法，其特征在于所述的鸟苷发酵每隔9h从三个平行样品中分别采集Iml的3份发酵液样品。
【文档编号】G01N21/3577GK104198431SQ201410456115
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月1日 优先权日:2014年9月1日
【发明者】杨天佑, 张明霞, 田静, 常景玲 申请人:河南科技学院