EB病毒NA1-IgA抗体检测试剂及其制备方法
【专利摘要】本发明提供一种EB病毒NA1-IgA抗体检测试剂，至少包括一反应膜，所述反应膜上划有检测线和质控线，所述检测线含有鼠抗人IgA单克隆抗体；所述质控线含有生物素；一抗原垫，所述抗原垫含有由生物素标记的重组EB病毒NA1抗原；一金标垫，所述金标垫含有胶体金标记的亲和素复合物。本发明的检测试剂盒具有快速、简便、准确和灵敏度高的特点。
【专利说明】EB病毒NA1 -1 gA抗体检测试剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，具体地涉及一种抗体检测试剂。
[0002] 本发明还涉及包含该检测试剂的试剂盒及制备方法。
【背景技术】
[0003] EB 病毒（epstein-barr virus, EBv)，又称人类疱疫病毒 4 型（Human herpesvirus 4 (HHV-4))。Epstein和Barr于1964年首次成功地将Burkitt非洲儿童淋巴瘤细胞通过体 外悬浮培养而建株，并在建株细胞涂片中用电镜观察到疱疹病毒颗粒，认为该病毒是多种 恶性肿瘤（如鼻咽癌）的病因之一，它主要感染人类口咽部的上皮细胞和B淋巴细胞。在 中国南方鼻咽癌患病人群中大多都检测到有EB病毒基因组存在。EB病毒分布广泛，多呈散 发性，亦可引起流行。EB病毒与鼻咽癌关系十分密切，EB病毒在感染过程中形成的病毒特 异抗原可以区分为早期抗原（EA)、病毒衣壳抗原（VCA)、核相关肿瘤抗原（EBNA)和膜抗原 (MA)。检测这些抗原的相应抗体反应，有助于EBV相关疾病的诊断和治疗。
[0004] 病毒衣壳抗原（VCA)具有很强的免疫原性，最初感染EBV的患者血清中可检测到 VCA-IgM，之后IgM抗体逐渐减少到无法检出的水平，几乎同时VCA-IgG逐渐增加，并可在正 常人体内终生存在。若此试验阴性，可以排除EBV感染。
[0005] 核相关肿瘤抗原（EBNA)可分为六种，其中NA1抗原是唯 种在所有EB病毒相 关肿瘤细胞中都表达的病毒蛋白，出现在所有持续受感染细胞的核中，其免疫原性表达相 对迟些，仅数周或数月后形成抗NA1抗体。一个明显阳性试验结果（第二滴度阶段）显示 曾有过感染。若VCA试验阳性，滴度为1 :160或更高，结合阴性或弱阳性的抗EBNA1试验， 就表示一种急性、新的或复发感染。
[0006] 因此，EB病毒NA1抗原的检测对于鼻咽癌的早期诊断和发展预后判断有非常重要 的意义。
[0007] 目前检测EB病毒NAl-IgA的检测试剂主要是采用酶联免疫吸附（ELISA)法、 Real-time定量PCR法等，但存在操作复杂、检测灵敏度较低、检测时间长的缺陷。
[0008] 胶体金是由氯金酸（HAUC14)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用 下，可聚合成一定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，形成带负电的 疏水胶溶液，故称胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形 成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋 白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一 些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性， 因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。
[0009] 免疫金标记技术（Immunogold labelling techique)主要利用了金颗粒具有高电 子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配 体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方 法中。
[0010] 胶体金法检测试剂将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂 (抗体或单克隆抗体）吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛 细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗 体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带 上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。
[0011] 中国专利申请CN101949932A提供了一种胶体金法检测EB病毒IgA抗体的检测试 齐?，其采用EB病毒NA1抗原包被检测线，鼠抗人IgA单抗标记胶体金，用羊抗鼠 IgG抗体包 被质控线。中国专利申请CN102539768A提供了一种EB病毒Zta IgA抗体胶体金检测试剂， 其采用EB病毒Zta抗原包被检测线，鼠抗人IgA单抗标记胶体金，用羊抗鼠 IgG抗体包被 质控线。
[0012] 以上两种胶体金法检测试剂均采用EB病毒抗原包被检测线，检测线的抗原可与 检测样本中的EB病毒IgG、IgA、IgM等所有抗体反应，由于IgG是血清中免疫球蛋白主成 分，约占血清中免疫球蛋白总含量的75%，是检测目标IgA抗体的4?7倍，可严重竞争干 扰检测目标IgA与包被EB病毒抗原的结合，造成检测结果灵敏度与特异性降低。
【发明内容】
[0013] 本发明的一个目的在于提供一种EB病毒NAl-IgA抗体检测试剂，用鼠抗人IgA单 克隆抗体划检测线，并引入生物素-亲和素系统，直接捕获检测样本中的全部IgA抗体，可 以有效的避免IgG、IgM等抗体的干扰，提高检出的灵敏度与特异性。
[0014] 本发明的另一个目的在于提供一种EB病毒NAl-IgA抗体检测试剂盒。
[0015] 本发明还提供所述检测试剂的制备方法。
[0016] 根据本发明的一方面，一种EB病毒NAl-IgA抗体检测试剂，至少包括
[0017] -反应膜，所述反应膜上划有检测线和质控线，所述检测线含有鼠抗人IgA单克 隆抗体；所述质控线含有生物素；
[0018] 一抗原垫，所述抗原垫含有由生物素标记的重组EB病毒NA1抗原；
[0019] 一金标垫，所述金标垫含有胶体金标记的亲和素复合物。
[0020] 所述的EB病毒NAl-IgA抗体检测试剂，其中优选地，所述检测线以包被浓度为 1. 4mg/ml的鼠抗人IgA单克隆抗体划线，所述质控线以包被浓度为2. 2mg/ml的生物素划 线，所述胶体金标记的亲和素复合物中亲和素的标记浓度为25μ g/ml，所述生物素标记的 重组EB病毒NA1抗原中生物素的标记浓度为30 μ g/ml。
[0021] 所述的EB病毒NAl-IgA抗体检测试剂，进一步包括一用于加载检测样品的样品 垫。
[0022] 根据本发明的另一方面，提供一种检测试剂盒，其包括所述的EB病毒NAl-IgA抗 体检测试剂，以及与之同时提供的相关使用说明、辅助检测工具、试剂和/或商品销售信 肩、。
[0023] 根据本发明的再一方面，提供制备权利要求1所述的EB病毒NAl-IgA抗体检测试 剂的方法，包括：
[0024] 1)划线NC膜的制备：用包被浓度的鼠抗人IgA单克隆抗体在NC膜上划检测线； 用包被浓度的生物素在NC膜上划质控线；
[0025] 2)金标垫的制备：将标记浓度的亲和素与胶体金偶联制备胶体金标记的亲和素 复合物，浸泡涂抹玻璃纤维素膜制备金标垫；
[0026] 3)抗原垫的制备：将标记浓度的生物素与重组EB病毒NA1抗原进行偶联制得生 物素标记的重组EB病毒NA1抗原复合物，浸泡涂抹玻璃纤维素膜制备抗原垫。
[0027] 本发明所述的方法，优选地包括下述步骤：
[0028] (1)划线NC膜的制备：用磷酸盐缓冲液将鼠抗人IgA单克隆抗体稀释到包被浓度 为1. 4mg/ml，将生物素稀释成包被浓度为2. 2mg/ml，用金标划线机将两种包被液划到NC膜 上，干燥后保存备用；
[0029] (2)金标垫的制备：将标记浓度为25 μ g/ml的亲和素与胶体金进行偶联制得胶体 金标记的亲和素复合物，以转速为10000转/分钟离心30分钟，弃上清，加入胶体金结合物 稀释液至原体积的80 %，然后用稀释液按60 μ Ι/cm2浸泡涂抹玻璃纤维素膜制成金标垫，干 燥后保存备用；
[0030] (3)抗原垫的制备：将标记浓度为30 μ g/ml的生物素与重组EB病毒NA1抗原进 行偶联制得生物素标记的重组EB病毒NA1抗原复合物，将混合液按60 μ Ι/cm2浸泡涂抹玻 璃纤维素膜制成抗原垫，干燥后保存备用；
[0031] (4)切割装配：将划线NC膜、金标垫、抗原垫、吸水纸、样品垫装配成反应板，再用 切条机切成4mm的试纸条，装卡后，装入错箔袋内制成检测试剂。
[0032] 本发明所述的方法，其中NC膜、金标垫和抗原垫的制备中干燥条件为37°C干燥3 小时。
[0033] 本发明所述的方法，其中步骤1)中，检测线的包被浓度为1.4mg/ml，按0. 15μ 1/ mm的包被量包被NC膜检测线；步骤2)中胶体金的制备方法包括：在100ml双蒸水中加入 1 %氯金酸溶液1. 〇ml煮沸，在搅拌条件下加入1. 4ml的1 %柠檬酸三钠溶液，继续煮沸5分 钟，自然冷却待用；胶体金标记亲和素的pH为9. 0?10. 0,亲和素浓度为25 μ g/ml,胶体金 标记亲和素稀释比例为1:8,金标垫的制备条件为稀释后的胶体金结合物按60μ 1/cm2浸泡 涂抹；步骤3)中，生物素的标记量为30 μ g/ml，质控线生物素浓度为2. 2mg/ml。
[0034] 本发明采用胶体金免疫层析法，将鼠抗人IgA单克隆抗体、生物素分别以条带状 固定在NC膜上，金标记的亲和素吸附在金标垫上，生物素标记的重组EB病毒NA1抗原吸附 在抗原垫上，含有EB病毒NA1抗体的待测样品加到试纸条的样品垫上后，通过毛细作用向 前移动，溶解抗原垫上的生物素标记的重组EB病毒NA1抗原和金标垫上的胶体金标记的亲 和素后相互反应，再移动至固定在NC膜的鼠抗人IgA单克隆抗体区域反应形成金标记免疫 复合物而被截留，聚集在检测带上。通过可目测的胶体金标记物检测人血清或血浆中的EB 病毒NAl-IgA抗体。
[0035] 本发明用鼠抗人IgA单克隆抗体划检测线，直接捕获检测样本中的全部IgA抗体， 可以有效的避免IgG、IgM等抗体的干扰，提1?检出的灵敏度与特异性。
[0036] 本发明引进生物素-亲和素系统（BAS)，这是一种新型生物反应放大系统。亲和素 与生物素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度专一性。亲和素结合生物素的亲和常 数可为抗原-抗体反应的百万倍，二者结合形成复合物的解离常数很小，呈不可逆反应性； 而且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶以及有机溶剂均不影响其结合。因此，BAS在实际应用中， 产物的稳定性高，从而可降低操作误差，提高测定的精确度。此外，每个亲和素分子有四个 生物素结合部位，因此，BAS具有多级放大作用，使其在应用时可极大地提高检测方法的灵 敏度。
[0037] 本发明的有益效果为：EB病毒NAl-IgA抗体检测试剂盒（胶体金法）具有快速、 简便、准确和灵敏度高的特点，整个操作时间仅需20分钟就可判读结果，不需要辅助仪器， 可直接肉眼观察结果，适用范围广，可单份检测，易于普及，对于EB病毒的检测和控制效果 明显。
[0038] 附图简述
[0039] 图1为本发明检测试剂的生产工艺流程和检测原理图。
【具体实施方式】
[0040] 下面结合附图，通过对本发明【具体实施方式】的描述，详细说明但不限制本发明。
[0041] 材料来源：以下材料除非特别说明均由市售商购。
[0042] 实施例1检测试剂制各备件筛诜
[0043] 1.胶体金颗粒的选择
[0044] 1. 1原理：根据煮沸条件下氯金酸与柠檬酸三钠发生氧化还原反应制备胶体金。 通过调节氯金酸和柠檬酸三钠的加入比例来改变和控制胶体金的颗粒大小。
[0045] 1. 2制备方法
[0046] 在100ml双蒸水中加入1 %氯金酸溶液1ml煮沸，在搅拌条件下加入不同量的1% 柠檬酸三钠溶液，继续煮沸5分钟以制备不同大小的胶体金颗粒，自然冷却待用。用不同大 小的胶体金标记亲和素，以企业内部质控品为研究材料进行检测，结果详见表1，表2。
[0047] 表1. 1 %柠檬酸三钠用量的选择实验一一胶体金颗粒大小的选择（1)
[0048]
【权利要求】
1. 一种EB病毒NAl-IgA抗体检测试剂，至少包括 一反应膜，所述反应膜上划有检测线和质控线，所述检测线含有鼠抗人IgA单克隆抗 体；所述质控线含有生物素； 一抗原垫，所述抗原垫含有由生物素标记的重组EB病毒NA1抗原； 一金标垫，所述金标垫含有胶体金标记的亲和素复合物。
2. 权利要求1所述的EB病毒NAl-IgA抗体检测试剂，其特征在于所述检测线以包被浓 度为1. 4mg/ml的鼠抗人IgA单克隆抗体划线，所述质控线以包被浓度为彡2. 2mg/ml的生 物素划线，所述胶体金标记的亲和素复合物中亲和素的标记浓度为30?40 μ g/ml，所述生 物素标记的重组EB病毒ΝΑΙ抗原中生物素的标记浓度为25?30 μ g/ml。
3. 权利要求1所述的EB病毒NAl-IgA抗体检测试剂，其特征在于进一步包括一用于加 载检测样品的样品垫。
4. 一种检测试剂盒，其包括权利要求1所述的EB病毒NAl-IgA抗体检测试剂。
5. 制备权利要求1所述的EB病毒NAl-IgA抗体检测试剂的方法，包括： 1) 划线NC膜的制备：用包被浓度的鼠抗人IgA单克隆抗体在NC膜上划检测线；用包 被浓度的生物素在NC膜上划质控线； 2) 金标垫的制备：将标记浓度的亲和素与胶体金偶联制备胶体金标记的亲和素复合 物，浸泡涂抹玻璃纤维素膜制备金标垫； 3) 抗原垫的制备：将标记浓度的生物素与重组EB病毒NA1抗原进行偶联制得生物素 标记的重组EB病毒NA1抗原复合物，浸泡涂抹玻璃纤维素膜制备抗原垫。
6. 权利要求5所述的方法，包括： (1) 划线NC膜的制备：用磷酸盐缓冲液将鼠抗人IgA单克隆抗体稀释到包被浓度为 1. 4mg/ml，将生物素稀释成包被浓度为彡2. 2mg/ml，用金标划线机将两种包被液划到NC膜 上，干燥后保存备用； (2) 金标垫的制备：将标记浓度为30?40 μ g/ml的亲和素与胶体金进行偶联制得胶 体金标记的亲和素复合物，以转速为10000转/分钟离心30分钟，弃上清，加入胶体金结合 物稀释液至原体积的80 %，然后用稀释液按60 μ Ι/cm2浸泡涂抹玻璃纤维素膜制成金标垫， 干燥后保存备用； ⑶抗原垫的制备：将标记浓度为25?30 μ g/ml的生物素与重组EB病毒NA1抗原进 行偶联制得生物素标记的重组EB病毒NA1抗原复合物，将混合液按60 μ Ι/cm2浸泡涂抹玻 璃纤维素膜制成抗原垫，干燥后保存备用； (4)切割装配：将划线NC膜、金标垫、抗原垫、吸水纸、样品垫装配成反应板，再用切条 机切成4mm的试纸条，装卡后，装入错箔袋内制成检测试剂。
7. 权利要求6所述的方法，其中NC膜、金标垫和抗原垫的制备中干燥条件为37°C干燥 3小时。
8. 权利要求5所述的方法，其中步骤1)中，检测线的包被浓度为1. 4mg/ml，按 0. 15 μ Ι/mm的包被量包被NC膜检测线。
9. 权利要求5所述的方法，其中步骤2)中胶体金的制备方法包括：在100ml双蒸水中 加入1 %氯金酸溶液1. 〇ml煮沸，在搅拌条件下加入1. 4ml的1 %柠檬酸三钠溶液，继续煮 沸5分钟，自然冷却待用；胶体金标记亲和素的pH为9. 0?10. 0,亲和素浓度为30 μ g/ml, 胶体金标记亲和素稀释比例为1:8,金标垫的制备条件为稀释后的胶体金结合物按60μ 1/ cm2浸泡涂抹。
10.权利要求5所述的方法，其中步骤3)中，生物素的标记量为30 μ g/ml，质控线生物 素浓度为2. 2mg/ml。
【文档编号】G01N33/569GK104297472SQ201410472951
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月16日 优先权日:2014年9月16日
【发明者】唐安洲, 王胜岚, 叶为民, 张哲 , 宋小冬, 李峰 申请人:中山生物工程有限公司