一种细胞内黑色素的快速检测与成像的方法
【专利摘要】本发明公开了一种细胞内黑色素的快速检测与成像的方法，包括以下步骤：配制氨银溶液、氯金酸水溶液和硫代硫酸钠水溶液；(2)取黑色素细胞，采用培养液培养后，制成细胞爬片，将细胞爬片置于氨银溶液中孵育、清洗后，加入氯金酸水溶液孵育、清洗后，再采用硫代硫酸钠水溶液处理后洗净，制得金属-黑色素复合材料；(3)选用NIR激光，对金属-黑色素复合材料进行照射，采用拉曼光谱仪器进行信号采集并成像，从成像图中获取黑色素的定位和分布信息以及每个黑色素检测点的量化光谱曲线及强度值，实现黑色素的快速检测与成像。该方法灵敏度高、检测时间短，可定性和定量检测细胞内黑色素。
【专利说明】—种细胞内黑色素的快速检测与成像的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于黑色素检测【技术领域】，具体涉及一种细胞内黑色素的快速检测与成像的方法。
技术背景
[0002]黑色素是一种普遍存在于生物系统的色素，它的存在与人体皮肤、毛发及眼睛的颜色密切相关。黑色素的主要生物功能有光保护、光感受器屏蔽、温度调节、伪装和显示、等，因此，它的存在以及含量有着极为重要的生物学意义。在皮肤中，黑色素是由处于基底层的黑素细胞合成的，并通过逐步的组装为成熟的黑素小体，最终从黑素细胞内分泌到邻近的角质形成细胞内，导致皮肤的色素沉着。黑色素决定着人们的肤色，皮肤颜色的深浅是由黑色素的含量决定的。一些环境因素如紫外线、化学物质等会引发皮肤中黑色素的含量增强，使得皮肤颜色加深。现阶段，白皙的皮肤是众多亚洲人群(特别是女性)所追求的目标，这就要求采取各种美白手段来实现皮肤的美白。而对于美白试剂的开发，黑色素是其最直接的作用靶点。另外，黑色素还与一些皮肤疾病密切相关，如:痣、黑色素瘤等等。因此，开发一种快速、有效的黑色素检测方法将具有很好的实用价值和现实意义。
[0003]黑色素是一种包含有多种二羟基吲哚和苯酚单位的异质聚合物，是皮肤组织中最重要的一种生色团之一。这一独特的化学结构决定了黑色素具有良好的光学性质，如:光吸收、荧光及拉曼散射，等。因此，可以利用光学的方法来实现黑色素的检测。相对于传统的黑色素检测方法(如:多巴氧化酶法、硫酸亚铁吸收法、亚铁氰化钾法和银浸染色法等)，光学检测方法有望实现灵敏度高，可同时得到定性和定量的数据的黑色素检测。目前，已发现有基于吸收光谱技术、荧光光谱技术或拉曼光谱技术的方法来实现黑色素的检测:1)基于吸收光谱的黑色素检测方法，由于黑色素在紫外-可见光区域有着较强的吸收，这种光吸收随着波长的增大而逐渐降低；利用这种光吸收的性质可实现黑色素的检测。但是，黑色素的吸收光谱的特异性比较低，与皮肤中其他生色团(如:血卟啉)的光谱特性区别不大；因此，这种方法的检测准确性有待考量。2)基于荧光光谱的黑色素检测方法，在近红外(near-1nfrared, NIR)光激发下,黑色素可发出宽谱的NIR突光；利用这一特性，实现了黑色素的NIR荧光成像。这一方法的缺点是，荧光光谱很宽，容易发生重叠；荧光较弱，实现黑色素成像需要花费的时间比较多。3)基于拉曼光谱的黑色素检测方法，黑色素具有特征的拉曼光谱(拉曼光谱被视为“指纹图谱”，具有唯一性)，可实现黑色素的拉曼检测。同样的，皮肤组织中正常的黑色素拉曼信号也很弱，获取到可识别的黑色素的拉曼光谱需要较长的时间。至今未有利用拉曼光谱实现黑色素成像的报道出现。
[0004]表面增强拉曼-突光联合光谱编码(surface enhanced Ramanscattering(SERS)-fluorescence joint spectral encoding(SFJSE))方法是一种结合了 SERS和荧光的联合光谱技术，两种光谱方法在其中优势互补，既能够弥补荧光谱易重叠的缺点又能在很大程度上增强拉曼的信号值。SFJSE技术通过构建一种既能发出荧光又具有SERS特性的金属纳米复合物，为目标物提供荧光及SERS双光谱标记，达到更为灵敏的检测。
[0005]现有的黑色素显色方法主要依靠一些特殊的染色处理来实现黑色素的特异染色。然后将染色后的样品置于光镜下观察并拍照。光镜下可见黑色素及嗜银细胞颗粒呈黑色，其他组织呈粉红色。
[0006]该技术的缺点可总结为以下几点:
[0007](I)灵敏度不高。在光镜下肉眼判断黑色素是否存在，只有达到肉眼可识别的颗粒大小才能被检测出，那些更小的颗粒则无法检测。
[0008](2)假阳性结果。银镜反应时间较长，且反应到一定时间后需要随时观察以防止过度反应导致的假阳性结果。
[0009](3)定性检测。该法的检测标准是通过肉眼的判定，只能得到定性的结果，无法定量。
[0010]以荧光和拉曼光谱为技术的黑色素检测方法，是根据黑色素特有的荧光和拉曼信号来实现黑色素的精确检测，有望实现黑色素的定量检测。该方法以NIR激光为激发光源，对黑色素含量较高的皮肤区域进行照射，采用荧光光谱或拉曼光谱仪器进行信号采集，从而实现黑色素的精确检测。
[0011]该技术的缺点可总结为以下几点:
[0012]光谱扫描时间长。由于黑色素的荧光信号及拉曼信号不是太强，因此在激发光不损伤皮肤的前提条件下，获取得到一个较好的光谱信号需要较长的扫描时间。特别是拉曼光谱，至今未发现有利用拉曼光谱实现黑色素成像的报道出现。
[0013]灵敏度不够高。由于黑色素的光谱信号不够强，只有在黑色素分布较多的皮肤部位才能够得到较好的检测结果。
[0014]本发明中采用的缩略语和关键术语定义:
[0015]拉曼散射(Raman scattering): 一种光子的非弹性散射现象。当光线从一个原子或分子散射出来时，绝大多数的光子，都是弹性散射的，这称为瑞利散射。在瑞利散射下，散射出来的光子，跟射入时的光子，它的能量、频率与波长是相同的。然而，有一小部份散射的光子(大约是一千万个光子中会出现一个)，散射后的频率会产生变化，通常是低于射入时的光子频率，原因是入射光子和介质分子之间发生能量交换。这即是拉曼散射。根据拉曼散射效应可以得到物质拉曼光谱，每一种物质都具有自己独特的拉曼光谱，即分子指纹图谱。
[0016]表面增强拉曼散射(surface-enhancedRaman scattering, SERS):当一些分子吸附在某些粗糙的金属(如金、银和铜等)表面时，其拉曼信号会得到极大的增强，这一现象就叫SERS效应。SERS的增强因子可高达114?1150
[0017]表面增强拉曼-突光联合光谱编码(surface enhanced Ramanscattering(SERS)-fluorescence joint spectral encoding(SFJSE))方法是一种结合了SERS和荧光的联合光谱技术，通过构建一种既能发出荧光又具有SERS特性的金属纳米复合物，为目标物提供荧光及SERS双光谱标记。
【发明内容】
[0018]本发明的目的是提供一种细胞内黑色素的快速检测与成像的方法，该方法灵敏度高、检测时间短，可定性和定量检测细胞内黑色素。
[0019]本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的:一种细胞内黑色素的快速检测与成像的方法，包括以下步骤:
[0020](I)配制氨银溶液、氯金酸水溶液和硫代硫酸钠水溶液；
[0021](2)取黑色素细胞，采用培养液培养后，制备细胞爬片，将细胞爬片置于步骤(I)配制的氨银溶液中，调节温度为56°C?60°C (较佳为56°C )孵育5?20min，清洗后加入步骤(I)配制的氯金酸水溶液孵育2?5min，清洗后再采用步骤(I)配制的硫代硫酸钠水溶液处理I?3min后洗净，制得金属-黑色素复合材料；
[0022](3)选用NIR激光，对金属-黑色素复合材料进行照射，采用拉曼光谱仪器进行信号采集，选取1000?1700CHT1范围的光谱强度值进行成像，从成像图中获取黑色素的定位和分布信息以及每个黑色素检测点的量化光谱曲线及强度值，实现黑色素的快速检测与成像。
[0023]在上述细胞内黑色素的快速检测与成像的方法中:
[0024]步骤(I)中氨银溶液的配制过程是:选取硝酸银水溶液，逐滴加入氨水，边加边摇晃，直到沉淀颗粒消失，然后再加入硝酸银水溶液，直到液体出现非常浅的乳白色时停止滴力口，将此液稀释后过滤使用或直接使用，其中硝酸银水溶液的浓度为40?50g/L，较佳为50g/L。
[0025]步骤(I)中氯金酸水溶液的浓度优选为4?5mM，较佳为5mM，硫代硫酸钠水溶液的浓度优选为40?60g/L，较佳为50g/L。
[0026]步骤(2)中培养液优选为RPM1-1640培养液；采用培养液培养时采用CO2培养箱，37°C，含体积百分含量为5%的CO2，贴壁培养。
[0027]步骤⑵中细胞爬片置于步骤⑴配制的氨银溶液前，先用PBS清洗I?3次后再用体积百分含量为4?10% (较佳为4% )的中性甲醛固定5?lOmin，超纯水清洗。
[0028]步骤(2)中清洗或洗净采用超纯水。
[0029]步骤(3)中激光波长优选为785nm，功率优选为2?25mW，中心波长1350cm—1。
[0030]步骤(3)中信号采集可采用点扫描模式或线扫描模式，对于点扫描模式，曝光时间为5?1s,对于线扫描模式,曝光时间为I?2s。
[0031]本发明通过引入纳米技术在黑色素细胞内黑色素所在的位置上进行原位的黑色素-金属复合材料构建，所构建的金属-黑色素复合材料能够显著增强黑色素本身光谱性质(荧光及SERS)，采用SFJSE方法可以实现更快、更灵敏的黑色素检测。
[0032]本发明中细胞内黑色素还原银离子的反应是一种纳米银的合成反应，再引入氯金酸发生置换反应，生成含银/金双金属与黑色素的纳米复合结构。但由于生物体系的复杂性，在细胞内合成的黑色素-金属复合结构可能是呈聚集的状态，有些聚集体足够大到能够在光学显微镜下即可识别。本发明中的光谱信号得到增强，说明这种聚集体是由纳米级别的金属颗粒堆积起来的，因为非纳米级别的金属粒子是没有信号增强的功能的。
[0033]与现有技术相比，本发明具有如下优点:
[0034](I)光谱扫描时间大大减少，引入了纳米技术在细胞内黑色素所在位置进行原位的金属复合粒子的构建，既增强了黑色素本身的拉曼信号，又极大地提高了整个复合物的荧光性质，采用SFJSE方法可以实现黑色素的快速检测；
[0035](2)灵敏度高，拉曼及荧光性质的显著增强，可实现更微小尺度的黑色素探测；
[0036](3)可定量检测，将光谱数据量化可实现黑色素的定量检测。
[0037](4)黑色素定位，获取黑色素特有的光谱数据进行细胞成像，可实现黑色素在细胞内的精确定位。
【专利附图】
【附图说明】
[0038]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
[0039]图1是实施例1中黑色素细胞的光谱成像图对照，其中A图为未经氨银溶液处理的黑色素细胞的正常光谱成像图图为经氨银溶液处理的黑色素细胞的SFJSE成像图，其中左图表示黑色素细胞在显微镜下观察到的亮场图像，中间图表示光谱成像图，右图表示亮场图与光谱成像图的重叠图像，其中B图中a表示从细胞质靠近细胞核富含内质网的区域获取的SFJSE谱线；b表示从细胞核区域获取的光谱线；c表示从细胞质另一区域获取的光谱线；
[0040]图2是实施例2中从图1所示黑色素细胞内不同区域获取的光谱曲线，其中A图表示从图1中的a、b和c区域获取的光谱曲线，a表示从细胞质靠近细胞核富含内质网的区域获取的SFJSE谱线；b表示从细胞核区域获取的光谱线；c表示从细胞质另一区域获取的光谱线，B图显示了三条光谱线在900?1800CHT1范围的SFJSE信号强度值；
[0041]图3是实施例3中SFJSE成像显示经过IBMX处理后细胞内黑色素的生成与分泌的过程，其中左图表示黑色素细胞在显微镜下观察到的亮场图像；中间图表示光谱成像图；右图表示亮场图与光谱成像图的重叠图像。
【具体实施方式】
[0042]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0043]实施例1
[0044]本实施例提供的细胞内黑色素的快速检测与成像的方法，包括以下步骤:
[0045](I)试剂配制，氨银溶液:取浓度为50g/L的硝酸银水溶液(浓度在40?50g/L范围内均可，此处为优选)20mL先倒入烧杯中10mL，逐滴加入氨水，边加边摇晃，直到沉淀颗粒消失，然后再向烧杯中滴加50g/L硝酸银水溶液，直到液体出现非常浅的乳白色时停止滴加，可以将此液稀释2倍后过滤(0.22μπι孔径)使用，也可以不稀释直接使用，不稀释直接使用时，反应更快一些，另外，再配制氯金酸水溶液(5mM)和海波液(即:硫代硫酸钠水溶液，50g/L)；
[0046](2)样品处理，黑色素(B16-F10)细胞采用RPM1-1640培养液(含10% FBS)进行培养(CO2培养箱，37°C，含5% CO2，贴壁培养)，处理前先用胰酶将细胞消化并接种于消毒的盖玻片上生长，达到一定的细胞密度后取出细胞爬片，PBS清洗3次后用4% (4?10%中性甲醛均可，此处仅为列举)中性甲醛固定lOmin，超纯水清洗，加入氨银溶液(爬片只需完全浸泡在氨银溶液中即可)于56°C (56?60°C温度范围内均可，此处仅为列举)湿盒内孵育20min，超纯水清洗后加入5mM氯金酸(滴加的方式加到爬片上，浸没爬片即可，氯金酸水溶液的浓度4?5mM范围内均可,此处仅为列举)孵育5min, 5%海波液(硫代硫酸钠水溶液，滴加的方式加到爬片上，浸没爬片即可，硫代硫酸钠水溶液的浓度40?60g/L范围内均可，此处仅为列举)处理2min后超纯水清洗干净；
[0047](3)光谱扫描与成像，光谱扫描设备采用一台显微拉曼光谱仪，选用NIR激光(785nm，功率12.5mff)激发，中心波长1350CHT1，未用氨银溶液处理的细胞设为对照，光谱扫描成像仪器选用雷尼绍invia型显微拉曼光谱系统，采用streamline扫描(线扫描)模式，曝光时间2s，选取1000?1700cm—1范围的光谱强度值进行成像。
[0048]从图1中可以看出，图1中A图:未经氨银溶液处理的黑色素细胞的正常光谱成像图；B图:黑色素细胞的SFJSE成像图。左图:黑色素细胞在显微镜下观察到的亮场图像；中间图:光谱成像图；右图:亮场图与光谱成像图的重叠图像。可以看到，在快速光谱扫描模式下，未采用SFJSE方法的黑色素细胞根本无法得到可识别的光谱成像图(A);而经过金属增强的细胞光谱图像可发现非常强烈的SFJSE信号(B)，这些信号存在于细胞质的位置，表明黑色素仅存在于细胞质中。
[0049]实施例2
[0050]本实施例提供的细胞内黑色素的快速检测与成像的方法，包括以下步骤:
[0051](I)试剂配制，氨银溶液:取50g/L的硝酸银水溶液20mL先倒入烧杯中10mL，逐滴加入氨水，边加边摇晃，直到沉淀颗粒消失，然后再向烧杯中滴加50g/L硝酸银水溶液，直到液体出现非常浅的乳白色时停止滴加，将此液稀释2倍后过滤(0.22μπι孔径)使用。另夕卜，再配制氯金酸水溶液(5mM)和海波液(即:硫代硫酸钠水溶液，50g/L)；
[0052](2)样品处理，黑色素(B16-F10)细胞采用RPM1-1640培养液(含10% FBS)进行培养(CO2培养箱，37°C，含5% CO2，贴壁培养)，处理前先用胰酶将细胞消化并接种于消毒的盖玻片上生长，达到一定的细胞密度后取出细胞爬片，PBS清洗3次后用4%中性甲醛固定5min,超纯水清洗,加入氨银溶液于56°C湿盒内孵育15min,超纯水清洗后加入5mM氯金酸孵育4min，5%海波液(硫代硫酸钠水溶液)处理2min后超纯水清洗干净；
[0053](3)光谱扫描与成像，光谱扫描设备采用一台显微拉曼光谱仪，选用NIR激光(785nm,功率25mW)激发，中心波长1350CHT1，未用氨银溶液处理的细胞设为对照，光谱扫描成像仪器选用雷尼绍invia型显微拉曼光谱系统，采用单点扫描模式，曝光时间5s，选取1000?1700cm-1范围的光谱强度值进行成像，并对细胞内不同区域点(图1中的a、b和c点)获取光谱曲线，曲线图见图2A，其中a表示从细胞质靠近细胞核富含内质网的区域获取的SFJSE谱线；b表示从细胞核区域获取的光谱线；c表示从细胞质另一区域获取的光谱线。图2B显示了三条光谱线900?1800CHT1范围的SFJSE信号强度值，定量的表示了细胞内这三个区域的黑色素含量。
[0054]实施例3
[0055]本实施例中采用SFJSE方法分析了经过黑色素生成刺激素(3-异丁基_1_甲基黄嘌呤，IBMX)的处理后，细胞内黑色素的生成及分泌情况。实施步骤如下:
[0056](I)试剂配制,氨银溶液:取50g/L的硝酸银水溶液20mL先倒入烧杯中1mL,逐滴加入氨水，边加边摇晃，直到沉淀颗粒消失，然后再向烧杯中滴加50g/L硝酸银水溶液，直到液体出现非常浅的乳白色时停止滴加，将此液稀释2倍后过滤(0.22μπι孔径)使用。另夕卜，再配制氯金酸水溶液(5mM)和海波液(即:硫代硫酸钠水溶液，50g/L)；
[0057](2)黑色素(B16-F10)细胞采用RPM1-1640培养液(含10% FBS)进行培养(CO2培养箱，37°C，含5% CO2，贴壁培养)。然后用胰酶将细胞消化并接种于消毒的盖玻片上生长，达到一定的细胞密度后弃培养液，加入含有100 μ M IBMX的培养液后放回C02培养箱继续培养，在不同的IBMX处理时间段取出细胞爬片，PBS清洗3次后用4%中性甲醛固定lOmin，超纯水清洗，再将细胞爬片放入氨银溶液中，置于56°C湿盒内孵育lOmin，超纯水清洗后加入5mM氯金酸孵育5min, 5%海波液(硫代硫酸钠水溶液)处理2min后超纯水清洗干净;
[0058](3)光谱扫描成像仪器选用雷尼绍invia型显微拉曼光谱系统，选用785nm激光(功率12.5mff)激发，中心波长ΠδΟαιΓ1,米用streamline扫描模式，曝光时间Is,选取1000?1700CHT1范围的光谱强度值进行成像。
[0059]结果如图3所示，图3中SFJSE成像显示经过IBMX处理后细胞内黑色素的生成与分泌的过程。左图:黑色素细胞在显微镜下观察到的亮场图像；中间图:光谱成像图；右图:亮场图与光谱成像图的重叠图像。Oh:1BMX未处理时，细胞形态主要呈椭圆型及梭型；细胞内黑色素合成量较少，且主要分布于细胞核周边(糙面内质网集中区域)。6h:1BMX处理6h后，细胞形态开始发生显著变化，细长的树突开始形成；细胞内黑色素合成量开始增大，主要还是分布于细胞核周边，有一小部分沿着树突开始向细胞外运输。12h:1BMX处理12h后，含有大量细长树突的细胞形态成型；细胞内黑色素大量合成，树突内亦含有大量黑色素，表明黑色素持续沿着树突向细胞外运输。24h:1BMX处理24h后，细胞内黑色素主要集中在细胞边缘，等待向细胞外运输；细胞外基质中也发现有大量的分泌的黑色素存在。
[0060]IBMX是一种黑色素生成刺激试剂，可以刺激细胞合成大量的黑色素。该实施例使用IBMX来激发黑色素细胞合成与分泌黑色素这一生物学事件。然后用本发明方法来跟踪细胞内的这一生理事件，可以证明本发明方法的有效性。
[0061]虽然，上文中已经用一般性说明、【具体实施方式】及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【权利要求】
1.一种细胞内黑色素的快速检测与成像的方法，其特征是包括以下步骤: (1)配制氨银溶液、氯金酸水溶液和硫代硫酸钠水溶液； (2)取黑色素细胞，采用培养液培养后，制备细胞爬片，将细胞爬片置于步骤(I)配制的氨银溶液中，调节温度为56?60°C孵育5?20min，清洗后加入步骤(I)配制的氯金酸水溶液孵育2?5min，清洗后再采用步骤(I)配制的硫代硫酸钠水溶液处理I?3min后洗净，制得金属-黑色素复合材料； (3)选用NIR激光，对金属-黑色素复合材料进行照射，采用拉曼光谱仪器进行信号采集，选取1000?1700CHT1范围的光谱强度值进行成像，从成像图中获取黑色素的定位和分布信息以及每个黑色素检测点的量化光谱曲线及强度值，实现细胞内黑色素的快速检测与成像。
2.根据权利要求1所述的细胞内黑色素的快速检测与成像的方法，其特征是:步骤(I)中氨银溶液的配制过程是:选取硝酸银水溶液，逐滴加入氨水，边加边摇晃，直到沉淀颗粒消失，然后再加入硝酸银水溶液，直到液体出现非常浅的乳白色时停止滴加，其中硝酸银水溶液的浓度为40?50g/L。
3.根据权利要求1所述的细胞内黑色素的快速检测与成像的方法，其特征是:步骤(I)中氯金酸水溶液的浓度为4?5mM，硫代硫酸钠水溶液的浓度为40?60g/L。
4.根据权利要求1所述的细胞内黑色素的快速检测与成像的方法，其特征是:步骤(2)中培养液为RPM1-1640培养液；采用培养液培养时采用CO2培养箱，37°C，含体积百分含量为5%的CO2，贴壁培养。
5.根据权利要求1所述的细胞内黑色素的快速检测与成像的方法，其特征是:步骤(2)中细胞爬片置于步骤(I)配制的氨银溶液前，先用PBS清洗I?3次后再用体积百分含量为4?10%的中性甲醒固定5?1min,超纯水清洗。
6.根据权利要求1所述的细胞内黑色素的快速检测与成像的方法，其特征是:步骤(2)中清洗或洗净米用超纯水。
7.根据权利要求1所述的细胞内黑色素的快速检测与成像的方法，其特征是:步骤(3)中激光波长为785nm，功率为2?25mW，中心波长1350CHT1。
8.根据权利要求1所述的细胞内黑色素的快速检测与成像的方法，其特征是:步骤(3)中信号米集可米用点扫描模式或线扫描模式，对于点扫描模式，曝光时间为5?1s,对于线扫描模式，曝光时间为I?2s。
【文档编号】G01N21/65GK104297225SQ201410513894
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月29日 优先权日:2014年9月29日
【发明者】刘智明, 杨辉, 周艳, 郭周义, 叶丙刚, 陈浩琳, 李颂扬, 龙佳, 林锦 申请人:无限极（中国）有限公司