一种水痘病毒抗体检测用抗原片制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种水痘病毒抗体检测用抗原片制备方法，采用水痘带状疱疹病毒VZV84-7株作为感染毒株制备抗原片，与Oka株感染二倍体细胞相比较，该病毒感染敏感细胞后，其主要特点为该病毒CPE的表现形式散在，广泛的分布在细胞表面；选用Vero细胞作为细胞基质，比二倍体细胞分散的更充分，并且细胞形态更为完整，经感染病毒增殖后，CPE在细胞中广泛出现，用该病毒感染细胞制备抗原片更方便于观察以及对结果进行判定。解决了用FAMA法检测水痘抗体中抗原片质量不高及制片过程复杂化问题，同时延长抗原片的保存时间，为批量化制备抗原片提供了条件；本发明与传统方法相比较简单易行，可在-20~70℃冷冻保存至一年以上，质量无明显变化，镜检片结果不受影响。
【专利说明】一种水痘病毒抗体检测用抗原片制备方法
[0001]
【技术领域】： 本发明涉及一种水痘病毒抗体检测用抗原片制备方法，用水痘带状疱疹病毒感染细胞 至细胞病变后消化制成细胞悬液，再进行抗原片的制备，属于生物【技术领域】。
[0002]
【背景技术】： 目前常用的水痘-带状疱疹病毒抗体检测方法有FAM法、乳球测定法和ELISA方法。 ELISA方法方便快捷适合大规模样本检测，但在实际应用中存在假阴性率过高，不能很好的 反应抗体的保护性的缺陷。乳球测定法操作相对复杂，主观性强，适合小量样本检测。FAMA 法是目前国际上公认的水痘带状疱疹病毒抗体检测的金标准，具有灵敏度高，特异性强的 特点。
[0003] 传统的FAM法，各实验室均采用水痘带状疱疹病毒Oka株感染二倍体细胞制备抗 原片，因该病毒株感染细胞后，细胞病变的表现形式为带状CPE，故在制备抗原片时，出现病 毒在细胞上分散不均，对镜检及判定结果有一定的影响。并且使用传统方法制备的抗原片 保存期短，在-2(T-70°C保存条件下只能保存一个月左右。抗原片的稳定性和实验结果的可 重现性与抗原片的质量和保存时间密切相关，目前尚无文献报道如何延长抗原片的保存时 限及抗原片的制备新方法。
[0004]
【发明内容】
： 本发明提供了一种水痘病毒抗体检测用抗原片制备方法，解决用FAM法检测水痘抗 体中抗原片质量不高及制片过程复杂化问题，同时延长抗原片的保存时间，为批量化制备 抗原片提供了条件。
[0005] 本发明所述的一种水痘病毒抗体检测用抗原片制备方法，其特征在于包括如下步 骤： 水痘带状疱疹病毒病毒感染VZV易感细胞，置35°C培养箱培养至病毒复制高峰，经胰 蛋白酶消化，进行细胞计数，选择适宜的细胞数量制备病毒细胞悬液，将细胞悬液滴入12 孔载玻片上，经35°C培养、清洗、冷丙酮固定干燥后，保存于-2(T-70°C。
[0006] 本发明所述的感染用水痘带状疱疹病毒株优选为水痘带状疱疹病毒VZV 84-7 株。
[0007] 本发明所采用的细胞基质优选为Vero细胞。
[0008] 本发明所述的生长成单层的细胞密度2. 5 - 3. 5X IOVml之间。
[0009] 本发明所述的用于感染细胞毒种的病毒滴度在4. 9-5. 21gPFU/ml之间；感染复数 (MOI)为 0· 01-0. 05。
[0010] 本发明所述的水痘病毒抗体检测用抗原片制备方法，用于感染后细胞消化液的胰 蛋白酶使用浓度为0.25%。
[0011] 本发明所述的水痘病毒抗体检测用抗原片制备方法，用于制备（FAMA法)抗原片的 病毒细胞计数在1. 2-1. 8X 105/ml之间。
[0012] 本发明所述的水痘病毒抗体检测用抗原片制备方法，抗原片制备过程中，制备病 毒细胞悬液无需离心，丙酮固定细胞片后可回收使用。固定后的病毒细胞片无需经PBS浸 洗，可直接冻存。
[0013] 本发明提供一种水痘病毒抗体检测用抗原片制备方法，具体步骤如下： 选择生长至单层的Vero细胞，密度约为2. 5 - 3. 5X 105/ml ;水痘带状疱疹病毒株VZV 84-7病毒滴度为4. 9-5. 21gPFU/ml ;以感染复数0. 01-0. 05感染细胞；病毒感染液为含1% 谷氨酰胺、2%新生牛血清的MEM，用5. 6%NaHC03调pH值至7. 5±0. 1 ;将感染后细胞置35°C 恒温培养箱培养至病毒复制高峰；经〇. 25%胰蛋白酶消化无需离心，进行细胞计数；加入含 1%谷氨酰胺5%新生牛血清pH值7. 4±0. 1的MEM培养液，调节细胞浓度至I. 2?1. 8 X IO5/ ml，制备细胞悬液；将细胞悬液滴入12孔载玻片中，每孔2(Γ25 μ 1，将载玻片置于湿盒中， 放35°C、5%C02培养箱孵育30分钟后，PBS漂洗1次，自然晾干，直接用冷丙酮室温固定15 分钟，取出后，直接放入片盒中，-20°C保存。
[0014] 本发明的积极效果在于：采用水痘带状疱疹病毒VZV84-7株作为感染毒株制备抗 原片，与Oka株感染二倍体细胞相比较，该病毒感染敏感细胞后，其主要特点为该病毒CPE 的表现形式散在，广泛的分布在细胞表面；选用Vero细胞作为细胞基质，比二倍体细胞分 散的更充分，并且细胞形态更为完整，经感染病毒增殖后，CPE在细胞中广泛出现，用该病毒 感染细胞制备抗原片更方便于观察以及对结果进行判定。
[0015] 提供的抗原片制备方法简化了制备步骤，不经离心，直接用生长液悬浮细胞进行 滴片，使细胞处于一个更为适宜的条件下，细胞保持高度的完整性，制备的抗原片合格率更 高；制备的抗原片经滴片、清洗、晾干后用冷丙酮固定，冻存之前不需PBS再次清洗，节省了 试验时间和不必要的麻烦；解决了用FAMA法检测水痘抗体中抗原片质量不高及制片过程 复杂化问题，同时延长抗原片的保存时间，为批量化制备抗原片提供了条件；本发明与传统 方法相比较简单易行，可在-2(T70°C冷冻保存至一年以上，质量无明显变化，镜检片结果不 受影响。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1为vero细胞和2BS细胞制备抗原片荧光显微镜下观察效果比较图片。
【具体实施方式】
[0017] 以下实施方式进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制，在不背 离本发明精神和实质的情况下，对本发明的方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本 发明的范围。
[0018] 实施例1 选择生长至单层的Vero细胞，密度约为2. 5 - 3. 5X IO5Ail ;水痘带状疱疹病毒株VZV 84-7病毒滴度为4. 91gPFU/ml ;以感染复数0. 01感染细胞；病毒感染液为含1%谷氨酰胺、 2%新生牛血清的MEM，用5. 6%NaHC03调pH值至7. 5±0. 1 ;将感染后细胞置35°C恒温培养 箱培养至病毒复制高峰；经0. 25%胰蛋白酶消化，进行细胞计数；加入含1%谷氨酰胺5%新 生牛血清pH值7. 4±0. 1的MEM培养液，调节细胞浓度至I. 2?1. 8 X IO5Ail，制备细胞悬液； 将细胞悬液滴入12孔载玻片中，每孔20~25μ 1，将载玻片置于湿盒中，放35°C、5%C02培养 箱孵育30分钟后，PBS漂洗1次，自然晾干，直接用冷丙酮室温固定15分钟，取出后，直接 放入片盒中，_20°C保存。
[0019] 实施例2 选择生长至单层的Vero细胞，密度约为2. 5 - 3. 5XlOVml ;水痘带状疱疹病毒株VZV 84-7病毒滴度为5. 21gPFU/ml ;以感染复数0. 01感染细胞；病毒感染液为含1%谷氨酰胺、 2%新生牛血清的MEM，用5. 6%NaHC03调pH值至7. 5±0. 1 ;将感染后细胞置35°C恒温培养 箱培养至病毒复制高峰；经0. 25%胰蛋白酶消化，进行细胞计数；加入含1%谷氨酰胺5%新 生牛血清pH值7.4 ±0. 1的MEM培养液，调节细胞浓度至1.2?1. 8 X105/ml，制备细胞悬液； 将细胞悬液滴入12孔载玻片中，每孔20~25μ 1，将载玻片置于湿盒中，放35°C、5%C02培养 箱孵育30分钟后，PBS漂洗1次，自然晾干，直接用冷丙酮室温固定15分钟，取出后，直接 放入片盒中，_20°C保存。
[0020] 实施例3 选择生长至单层的Vero细胞，密度约为2. 5 - 3. 5 X IO5Ail ;水痘带状疱疹病毒株VZV 84-7病毒滴度为4. 91gPFU/ml ;以感染复数0. 05感染细胞；病毒感染液为含1%谷氨酰胺、 2%新生牛血清的MEM，用5. 6%NaHC03调pH值至7. 5±0. 1 ;将感染后细胞置35°C恒温培养 箱培养至病毒复制高峰；经0. 25%胰蛋白酶消化，进行细胞计数；加入含1%谷氨酰胺5%新 生牛血清pH值7.4 ±0. 1的MEM培养液，调节细胞浓度至1.2?1. 8 X105/ml，制备细胞悬液； 将细胞悬液滴入12孔载玻片中，每孔20~25μ 1，将载玻片置于湿盒中，放35°C、5%C02培养 箱孵育30分钟后，PBS漂洗1次，自然晾干，直接用冷丙酮室温固定15分钟，取出后，直接 放入片盒中，_20°C保存。
[0021] 实施例4 选择生长至单层的Vero细胞，密度约为2. 5 - 3. 5X IO5Ail ;水痘带状疱疹病毒株VZV 84-7病毒滴度为5. 21gPFU/ml ;以感染复数0. 05感染细胞；病毒感染液为含1%谷氨酰胺、 2%新生牛血清的MEM，用5. 6%NaHC03调pH值至7. 5±0. 1 ;将感染后细胞置35°C恒温培养 箱培养至病毒复制高峰；经0. 25%胰蛋白酶消化，进行细胞计数；加入含1%谷氨酰胺5%新 生牛血清pH值7.4 ±0. 1的MEM培养液，调节细胞浓度至1.2?1. 8 X105/ml，制备细胞悬液； 将细胞悬液滴入12孔载玻片中，每孔20~25μ 1，将载玻片置于湿盒中，放35°C、5%C02培养 箱孵育30分钟后，PBS漂洗1次，自然晾干，直接用冷丙酮室温固定15分钟，取出后，直接 放入片盒中，_20°C保存。
[0022] 通过以下传统的水痘病毒抗体检测用抗原片制备方法来比较本发明的积极效 果： 比较例1 水痘带状疱疹病毒VZV Oka株(滴度4. 91gPFU/ml)以0. Ol MOI感染生长至单层的2BS 细胞，细胞密度约2. 5~3. 5 X 105/ml之间。病毒感染液为含1%谷氨酰胺、2%新生牛血清的 MEM，用5. 6%NaHC03调pH值至7. 5±0. 1。置35°C恒温培养箱培养至病变高峰，经0. 25% 胰蛋白酶消化，加入生长液吹打细胞，收集细胞进行离心，沉淀中加入PBS重悬，经细胞 计数，调节细胞浓度至1.2?1.8X105/ml，滴入12孔载玻片中，每孔20?25μ 1，置35°C、 5%C02培养箱湿盒30分钟后冷丙酮室温固定15分钟，取出后，PBS清洗三次，晾干后放入片 盒中，-2(T-70°C保存。
[0023] 比较例2 水痘带状疱疹病毒VZV 84-7株(滴度4. 91gPFU/ml)以0. Ol MOI感染2BS细胞，细 胞密度约2. 5~3. 5 X 105/ml之间。病毒感染液为含1%谷氨酰胺2%新生牛血清的MEM，用 5. 6%NaHC03调PH值至7. 5 ±0. 1。将感染后细胞置35°C恒温培养箱培养至病毒复制高峰， 经0. 25%胰蛋白酶消化，进行细胞计数，加入MEM培养液，调节细胞浓度至I. 2~1. 8 X 105/ ml，制备细胞悬液。将细胞悬液滴入12孔载玻片中，每孔2(Γ25 μ 1，将载玻片置于湿盒中， 放35°C、5%C02培养箱孵育30分钟后，PBS清洗2次，自然晾干，直接用冷丙酮室温固定15 分钟，取出后，直接放入片盒中，-2(T-70°C保存。
[0024] 结论： 1、 实施例1与比较例1制备的抗原片倒置显微镜下观察细胞形态，细胞形态大小均匀， 饱满者符合下一步实验要求。采用同一批细胞，分别用两种方法制备抗原片，分别各100 片。显微镜下观察，比较两种方法制备的抗原片镜检合格率（％)，结果本发明采用的方法制 备的抗原片合格率明显高于传统方法。结果见表1 : 表1 :两种方法制备的抗原片镜检合格率比较
【权利要求】
1. 一种水痘病毒抗体检测用抗原片制备方法，其特征在于包括如下步骤： 水痘带状疱疹病毒病毒感染VZV易感细胞，置35°C培养箱培养至病毒复制高峰，经胰 蛋白酶消化，进行细胞计数，选择适宜的细胞数量制备病毒细胞悬液，将细胞悬液滴入12 孔载玻片上，经35°C培养、清洗、冷丙酮固定干燥后，保存于-2(T-70°C。
2. 此方法制备的抗原片可用于水痘-带状疱疹病毒抗体的测定。
3. 根据权利要求1所述的水痘病毒抗体检测用抗原片制备方法，其特征在于：感染用 水痘带状疱疹病毒株优选为水痘带状疱疹病毒VZV 84-7株。
4. 根据权利要求1所述的水痘病毒抗体检测用抗原片制备方法，其特征在于：所采用 的细胞基质优选为Vero细胞，细胞密度2. 5 - 3. 5X 105/ml之间。
5. 根据权利要求1所述水痘病毒抗体检测用抗原片制备方法，其特征在于：用于感染 细胞毒种的病毒滴度在4. 9-5. 21gPFU/ml之间；感染复数（M0I)为0. 01-0. 05。
6. 根据权利要求书1所述的水痘病毒抗体检测用抗原片制备方法，其特征在于：病毒 细胞悬液细胞计数在1. 2-1. 8X 105/ml之间。
7. -种水痘病毒抗体检测用抗原片制备方法，具体步骤如下： 选择生长至单层的Vero细胞，密度约为2. 5 - 3. 5X 105/ml ;水痘带状疱疹病毒株VZV 84-7病毒滴度为4. 9-5. 21gPFU/ml ;以感染复数0. 01-0. 05感染细胞；病毒感染液为含1% 谷氨酰胺、2%新生牛血清的MEM，用5. 6%NaHC03调pH值至7. 5±0. 1 ;将感染后细胞置35°C 恒温培养箱培养至病毒复制高峰；经〇. 25%胰蛋白酶消化，进行细胞计数；加入含1%谷氨 酰胺5%新生牛血清pH值7. 4 ±0. 1的MEM培养液，调节细胞浓度至1. 2?1. 8 X 105/ml，制备 细胞悬液；将细胞悬液滴入12孔载玻片中，每孔2(T25iil，将载玻片置于湿盒中，放35°C、 5%C02培养箱孵育30分钟后，PBS漂洗1次，自然晾干，直接用冷丙酮室温固定15分钟，取 出后，直接放入片盒中，_20°C保存。
【文档编号】G01N33/68GK104371981SQ201410551513
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年10月17日 优先权日:2014年10月17日
【发明者】沈红杰, 李海燕, 郑晓丽, 李生军, 赵海波, 闫磊, 朱晓文, 双慧, 张宇, 收到 申请人:长春祈健生物制品有限公司