金纳米簇为荧光探针的葡萄糖测定方法
【专利摘要】本发明公开一种 金纳米簇为荧光探针的葡萄糖测定方法, 涉及以N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米簇为荧光探针的葡萄糖测定方法，其特征是利用葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成H2O2，Fe2+催化H2O2产生羟自由基使金纳米簇的荧光发生猝灭，从而表现出荧光发射光谱特征的变化，可以用于葡萄糖的检测。在0.39~27.22μmol/L范围内金纳米簇荧光猝灭值ΔF650与葡萄糖浓度呈线性关系，检测限为0.18μmol/L。本发明灵敏度高，重现性好，可用于食品、工业、环境及生命体系中葡萄糖的测定。
【专利说明】金纳米簇为荧光探针的葡萄糖测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及以N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米簇为荧光探针的葡萄糖测定方 法，属于分析化学及纳米【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 葡萄糖是活细胞能量的主要来源，在生命过程中扮演着重要的角色。人体尿液或 者血液葡萄糖(血糖)浓度的异常变化是糖尿病或低血糖的诊断指标。血糖浓度受神经系统 和激素的调节而保持相对稳定，当这些调节失去原有的相对平衡时，则出现高血糖或低血 糖。血糖增高引起血糖增高的原因很多，除病理性原因外，也有属生理变化者。因此，准确、 快速测定血糖在临床诊断方面意义重大。目前，测定葡萄糖的方法主要有葡萄糖氧化酶法、 己糖激酶法及干化学法。发展新的葡萄糖检测手段仍然十分迫切。
[0003] 金纳米簇（goldnanoclusters,AuNCs)是一种新型的突光纳米材料，其具有尺 寸小、无毒、水溶性好、光稳定性好、Stokes位移大、比表面积大、制备条件温和、表面易于修 饰以及荧光性质随尺寸可调等突出优点，是近年来的研究热点，其已被广泛应用于催化、传 感检测、纳米标记、医学成像和光电子学等领域。
[0004] 本发明以N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米簇作为荧光探针，提供了一种简便、 灵敏的葡萄糖检测的新方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种以N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米簇为荧光探针的 葡萄糖的测定方法。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案： (一）金纳米簇荧光材料的制备 以下过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底清洗，晾干。金纳米 簇荧光材料的制备方法如下：将0. 6mL浓度为0. 5mol/L的氢氧化钠溶液与0. 4mL浓度 为0.02g/L的氯金酸溶液加入到4mL浓度为0.08mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中， 混匀，置于37°C恒温水浴槽中反应2. 5小时，反应液由浅黄色变为无色。反应结束后用截 留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理，纯化后的金纳米簇溶液放置于4°C冰 箱避光保存。
[0007](二）葡萄糖的测定 葡萄糖的测定分两步进行：（1)〇. 175毫升样品溶液（HEPES，20mmol/LpH=7.4)加入 0. 025毫升浓度为0. 1mg/mL的葡萄糖氧化酶，置于25°C反应30分钟；（2)将0. 05毫升 浓度为〇. 9mmol/L的亚铁离子（Fe2+)溶液(含40mmol/L硫酸）与0. 2毫升步骤(一）制备 的金纳米团簇溶液依次加入上述反应液中，摇匀后置于25°C水浴锅反应10分钟。反应结 束后，以355nm为激发波长，测定在650nm处的荧光强度值（F65CI)，通过F65(l标准曲线进行 葡萄糖的测定。
[0008] 本发明的优点： (1)本发明基于葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成H202,Fe2+催化H202产生羟自由基 (Fenton反应）使金纳米簇的荧光发生猝灭，从而表现出荧光发射光谱特征的变化，可以用 于葡萄糖的检测。
[0009] (2)本发明使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米簇材料其制备过程快速、简 便，不需要任何前修饰步骤。
[0010] (3)本发明所构建的方法测定特异性好、灵敏度高，检测限低至0. 18ymol/L。
[0011] (4)本发明所构建的方法无需复杂的样品前处理过程即可用于人血清葡萄糖的测 定。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图1为金纳米簇溶液在紫外灯下的外观对照图。图中：（A)金纳米簇溶液+ 0. 1 mg/mL葡萄糖氧化酶+ 100iimol/LFe2+;(B)金纳米簇溶液+ 80iimol/L葡萄糖+ 0. 1 mg/mL葡萄糖氧化酶 + 100umol/LFe2+。
[0013] 图2为金纳米簇溶液的荧光发射光谱图。图中：（A)金纳米簇溶液+ 0. 1mg/mL 葡萄糖氧化酶+ 100umol/LFe2+;(B)金纳米簇溶液+ 80iimol/L葡萄糖+ 0. 1mg/mL 葡萄糖氧化酶+ 1〇〇Umol/LFe2+。
[0014] 图3为葡萄糖氧化酶催化体系反应时间对金纳米簇溶液荧光强度的影响图。（葡 萄糖的浓度为40iimol/L)。
[0015] 图4为不同干扰物质对金纳米簇溶液荧光强度的影响图。
[0016] 图5为金纳米簇溶液的荧光强度变化值（AF65(I)与葡萄糖浓度之间的线性关系 图。
【具体实施方式】
[0017] 本发明所述的HEPES指N-(2-羟乙基）哌嗪-N' -2-乙烷磺酸。本发明实例所用 的Fe2+溶液为任一现有技术公开的Fe2+溶液，其优选为氯化亚铁溶于40mM硫酸配制而成 的Fe2+溶液。
[0018] 实例 1 : 将0. 6mL浓度为0. 5mol/L的氢氧化钠溶液与0. 4mL浓度为0. 02g/L的氯金酸溶 液加入到4mL浓度为0. 08mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37°C恒温 水浴槽中反应2.5h。反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理。 所得到的金纳米簇溶液可见光下为无色，紫外灯照射下产生强烈的红色荧光。4°C暗处保 存，能保持至少一个月的相对稳定。
[0019] 实例 2: 〇. 175毫升浓度为80i!mol/L的葡萄糖溶液(含HEPES--N- (2-羟乙基）哌 嗪-N' -2-乙烷磺酸，浓度20mmol/L、pH=7. 4)加入0. 025毫升浓度为0. 1mg/mL的葡萄 糖氧化酶，置于25°C反应30分钟。将0.05毫升浓度为0.9mmol/L的Fe2+溶液(含40 mm〇l/L硫酸）与0. 2毫升实例1制备的金纳米团簇溶液依次加入上述反应液中，摇匀后置 于25°C水浴锅反应10分钟。在紫外灯下观察，金纳米簇溶液本身显现红色荧光（图1中 的A)，而加入葡萄糖反应之后金纳米簇溶液红色荧光发生猝灭（图1中的B)。图2为金纳 米簇溶液（图2中的A)和加入葡萄糖反应之后金纳米簇溶液（图2中的B)的荧光发射光谱 图。
[0020] 实例 3 : 〇. 175 毫升浓度为 40i!mol/L的葡萄糖溶液（HEPES，20mmol/LpH=7. 4)加入 0. 025 毫升浓度为〇. 1mg/mL的葡萄糖氧化酶，置于25°C反应5~50分钟。将0. 05毫升浓度为 0. 9mmol/L的Fe2+溶液(含40mmol/L硫酸）与0. 2毫升实例1制备的金纳米团簇溶液依 次加入上述反应液中，摇匀置于25°C水浴锅反应10分钟。如图3所示，葡萄糖氧化酶催 化反应30分钟后，金纳米簇溶液荧光猝灭值△F65(l变化达到平稳，故选择葡萄糖氧化酶酶 催化反应时间为30分钟。
[0021] 实例 4: 〇. 175毫升浓度为40i!mol/L的葡萄糖溶液或浓度40i!mol/L的麦芽糖溶液或浓度 为400iimol/L的乳糖溶液或浓度为400iimol/L的果糖溶液（HEPES，20mmol/LpH=7. 4) 加入0. 025毫升浓度为0. 1mg/mL的葡萄糖氧化酶，置于25°C反应30分钟。将0. 05毫升 浓度为〇. 9mmol/L的Fe2+溶液(含40mmol/L硫酸）与0. 2毫升实例1制备的金纳米团簇 溶液依次加入上述反应液中，摇匀后置于25°C水浴锅反应10分钟，测定荧光强度值F65Q， 并计算出荧光猝灭值AF65(i。由图4可知，仅有40ymol/L的葡萄糖可使金纳米簇产生明 显的荧光猝灭，说明本发明所建立的方法抗干扰能力强。
[0022] 实例 5 : 0.175毫升含不同浓度葡萄糖的溶液（HEPES，20mmol/LpH=7. 4)加入0.025毫升浓度 为0.1mg/mL的葡萄糖氧化酶，置于25°C反应30分钟。将0.05毫升浓度为0.9mmol/ L的Fe2+溶液(含40mmol/L硫酸)与0. 2毫升实例1制备的金纳米团簇溶液依次加入上述 反应液中，摇匀后置于25°C水浴锅反应10分钟，测定荧光强度值F65(l。如图5所示，随着 葡萄糖浓度的不断增大，荧光猝灭值八^ 5(|逐渐减小，在0.39~27.22iimol/L范围内AF65Q 与葡萄糖浓度呈线性关系，检测限为〇. 18ymol/L。
[0023] 实例 6 : 0.175 毫升浓度为 7.78iimol/L葡萄糖的溶液（HEPES，20mmol/LpH=7. 4)加入 0.025 毫升浓度为〇. 1mg/mL的葡萄糖氧化酶，置于25°C反应30分钟。将0. 05毫升浓度为0. 9 mmol/L的Fe2+溶液(含40mmol/L硫酸）与0. 2毫升实例1制备的金纳米团簇溶液依次加 入上述反应液中，摇匀后置于25°C水浴锅反应10分钟，测定荧光强度值F65(l。重复上述 步骤12次，得相对标准偏差（RSD)为1. 9%，表明本方法重现性良好。
[0024] 实例 7 : 取新鲜人血液，先用截留分子量为3000的超滤管进行超滤，滤液用pH=7. 4的HEPES缓 冲液（20mmol/L)稀释200倍，取0. 175mL稀释液加入到0. 025毫升浓度为0. 1mg/mL的 葡萄糖氧化酶溶液中，置于25°C反应30分钟。将0.05毫升浓度为0.9mmol/L的Fe2+溶 液(含40mmol/L硫酸）与0. 2毫升实例1制备的金纳米团簇溶液依次加入上述反应液中， 摇匀后置于25°C水浴锅反应10分钟，测定荧光强度值F65(l。通过标准曲线进行定量，获 得血样中的葡萄糖含量。与标准方法测定结果进行比较，结果表明本发明所使用的方法与 标准方法无显著性差异(表1)。
[0025]表 1
【权利要求】
1. 一种金纳米簇为荧光探针的葡萄糖测定方法，其特征是利用葡萄糖氧化酶氧化葡萄 糖生成H202, Fe2+催化H202产生羟自由基使金纳米簇的荧光发生猝灭，从而表现出荧光发射 光谱特征的变化，能用于葡萄糖的检测。
2. 根据权利要求1所述的金纳米簇为荧光探针的葡萄糖测定方法，其特征是所使用的 N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备： 将浓度为〇? 02、. 18 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液和浓度为0? f 0? 8 mol/L的氢氧 化钠溶液加入到浓度为〇. 〇广〇. 1 g/L的氯金酸溶液中，混匀，置于2(T70° C水浴恒温反 应(T3. 5小时，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行透析纯化处理，得 到N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇荧光材料水溶液。
3. 根据权利要求1或2所述的金纳米簇为荧光探针的葡萄糖测定方法，其特征是所使 用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米簇优选采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的 方法制备：将浓度为0.08 mol/L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液和浓度为0. 5 mol/L的氢 氧化钠溶液加入到浓度为0.02 g/L的氯金酸溶液中，混匀，置于37° C水浴恒温反应2.5 小时，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行透析纯化处理，得到N-乙 酰-L-半胱氨酸-金纳米簇荧光材料水溶液。
4. 根据权利要求1或2所述的金纳米簇为荧光探针的葡萄糖测定方法，其特征是利用 N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米簇在650 nm处的发射光强度值（F65CI)以判断葡萄糖含 量，所使用的激发波长为355 nm。
5. -种金纳米簇为荧光探针的葡萄糖测定方法，包括如下步骤：1)将含不同浓度葡萄 糖的溶液，所述葡萄糖溶液中含有浓度为20 mmol/L、pH=7. 4的HEPES，加入葡萄糖氧化酶 溶液中，然后置于25° C反应5?50分钟；2)将含有浓度为40 mmol/L硫酸的Fe2+溶液与金 纳米团簇溶液依次加入步骤1)的反应液中，摇匀后置于25° C水浴锅反应1~15分钟，测定 荧光强度值F65(l，随着葡萄糖浓度的不断增大，F65(l逐渐减小，在0. 39~27. 22 y mol/L范围 内荧光猝灭值A F65(l与葡萄糖浓度呈线性关系，检测限为0. 18 y mol/L。
6. 根据权利要求5所述的金纳米簇为荧光探针的葡萄糖测定方法，其特征是步骤1)所 使用的葡萄糖氧化酶的浓度为〇. 1 mg/mL，反应时间为30分钟；步骤2)所使用Fe2+溶液的 终浓度为100 U mol/L，反应时间为10分钟。
7. 根据权利要求5或6所述的金纳米簇为荧光探针的葡萄糖测定方法，其特征是葡萄 糖溶液，葡萄糖氧化酶溶液，Fe2+溶液，金纳米簇溶液按体积比7 :1 :2 :8混合，反应总体积 为 0? 45 mL。
8. -种金纳米簇为荧光探针的血糖测定方法，包括如下步骤，1)取新鲜人血液，经超 滤处理后用pH=7. 4的缓冲液稀释，取0. 175 mL稀释液加入到0. 025毫升浓度为0. 1 mg/mL 的葡萄糖氧化酶溶液中，置于25° C反应30分钟；2)将0. 05毫升浓度为0. 9 mmol/L的含 有40 mmol/L硫酸的Fe2+溶液与0. 2毫升金纳米团簇溶液依次加入上述步骤1)的反应液 中，摇匀后置于25° C水浴锅反应10分钟，测定荧光强度值F65(l，通过标准曲线进行定量， 获得血样中的葡萄糖含量。
9. 根据权利要求5或8所述的金纳米簇为荧光探针的血糖测定方法，其特征是所使用 的金纳米簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备：将0. 6 mL浓度为0. 5 mol/ L的氢氧化钠溶液与0. 4 mL浓度为0. 02 g/L的氯金酸溶液加入到4 mL浓度为0. 08 mol/ L的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，混匀，置于37° C恒温水浴槽中反应2. 5 h，反应液由浅 黄色变为无色，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理，纯化后 的金纳米簇溶液放置于4° C冰箱避光保存。
10.根据权利要求8所述的金纳米簇为荧光探针的血糖测定方法，其特征是所述的新 鲜人血液用截留分子为3000的超滤管离心超滤，滤液用pH=7. 4的HEPES缓冲液稀释200 倍后测定。
【文档编号】G01N21/64GK104330393SQ201410614781
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年11月4日 优先权日:2014年11月4日
【发明者】陈伟, 邓豪华, 何栋, 许延瑜, 孙世杰 申请人:福建医科大学