Elisa方法定量测定人血清中重组人鼠嵌合抗cd20单克隆抗体浓度的制作方法
【专利摘要】本发明涉及ELISA方法定量测定人血清中重组人鼠嵌合抗CD20单克隆抗体浓度。具体而言，本发明提供测定血清中抗CD20单克隆抗体浓度的酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，所述方法使用抗CD20单克隆抗体的F(ab′)2片段免疫动物获得的多克隆抗体作为捕获抗体，使用IgG-F(ab′)2抗体作为检测抗体。本发明的方法具有良好的特异性、反复冻融稳定性、长期冻存稳定性等优点。
【专利说明】ELISA方法定量测定人血清中重组人鼠嵌合抗CD20单克隆 抗体浓度
【技术领域】
[0001] 本发明涉及定量测定血清中单克隆抗体药物浓度的方法。本发明的方法采用酶联 免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法对血清中抗CD20单克隆抗体 浓度进行分析，具有良好的灵敏度和特异性等优点。
【背景技术】
[0002] 非霍奇金淋巴瘤（NHL)是最常见的淋巴组织恶性肿瘤，其死亡率在我国居恶性肿 瘤中的第十位。NHL的传统治疗方案是以化疗为主，局部放疗、手术治疗为辅的综合治疗。 迄今为止，传统细胞毒化疗药物进一步提高恶性淋巴瘤临床疗效的空间十分有限，单克隆 抗体已经成为对经过选择的NHL患者较为成功的一种治疗方法。治疗B细胞性NHL最常用 的抗体靶目标包括⑶20、⑶22等。
[0003] ⑶20抗原位于前B和成熟B淋巴细胞的表面，而造血干细胞、正常浆细胞或其它 正常组织不表达⑶20。95%以上的B细胞型非霍奇金淋巴瘤瘤细胞表达⑶20。重组人鼠 嵌合抗CD20单克隆抗体与B细胞表面的CD20抗原特异性结合后，启动介导B细胞溶解的 免疫反应，作用机制包括补体依赖的细胞毒作用（CDC)、抗体依赖的细胞毒作用（ADCC)、生 长抑制作用等[1_2]。因此，⑶20抗原是靶向治疗非霍奇金淋巴瘤的有效靶点。国外同类品 种利妥昔单抗注射液（英文名称：Rituximab Injection ;商品名称：RiUixmi t利妥昔单抗 (商品名：美罗华））由IDEC/Genentech公司开发，于1997年11月获美国FDA批准用于NHL 治疗，1998年欧盟也批准该药上市。利妥昔单抗注射液于2000年3月在我国获得进口许 可。利妥昔单抗注射液上市规格为500mg/50ml、100mg/10ml，临床治疗NHL使用推荐剂量为 375mg/m2BSA (体表面积）。
[0004] 神州细胞工程有限公司研制的重组人鼠嵌合抗⑶20单克隆抗体SCT400是一种人 鼠嵌合IgGl型抗CD20单克隆抗体，能特异性地与跨膜抗原CD20结合，临床上拟单用或与 化药联合治疗非霍奇金淋巴瘤（NHL)。SCT400抗原结合位点和抗体可变区氨基酸序列与利 妥昔单抗完全相同，恒定区与利妥昔单抗在重链CHl区域仅有一个氨基酸差异（V219A)已 经开展了针对SCT400和利妥昔单抗在质量、临床前药效、安全性评价等方面的比较研究工 作。研究结果证明二者的理化特性、生物活性、体内外药效和药代动力学特征基本一致；临 床前安全性评价结果也证实二者具有高度相似和可比性。基于以上临床前数据和临床研 究，在中国医学科学院肿瘤医院和307医院展开了多中心、开放I期临床药代动力学试验。
[0005] 目前目前已经由多篇文献报道应用ELISA的方法检测人血清中利妥昔单抗的浓 度[Maloney et al, 1994 ；Berinstein et al, 1998 ；Tobinai et al, 1998 ；Iacona et al, 2000，Buem et al，2004;Cragg et al，2004;Hampson et al，2010]。但文献报道的多克隆 抗体，如纯化的多克隆羊抗IDEC C2B8抗体血清、羊抗人IgG结合辣根过氧化氢酶、商品化 的兔抗鼠 IgG或者是过氧化氢酶标记的羊抗鼠 IgG被用于一系列利妥昔单抗的临床研究 中，但是在这些临床研究中样本检测前需要稀释1/20000倍以上因为缺少特异性，且与正 常人IgG有交叉反应。因为这个原因，Cragg提出了使用特异的mAb MB2A4直接检测利妥 昔单抗的浓度，这种分析方法呈现出高的特异性，但是需要进行高通量筛选、费用昂贵因此 很难被广泛运用。并且这种抗独特性抗体只能检测游离的利妥昔单抗的浓度不能检测循环 的⑶20-利妥昔单抗的混合浓度。
[0006] 参考文献
[0007] Anderson KC，Bates MP，Slaughenhoupt BL，Pinkus GS，Schlossman SF，Nadler LM. 1984. Expression of human B cell associated antigens on leukemias and lymphomas ：A model of human B cell differentiation. Blood ；63 :1424-33.
[0008] Berinstein，N. L.，Grillo-Lopez，A. J.，White，C. A.，Bence-Bruckler，I.， Maloney，D.，Czuczman，M.，Green，D.，Rosenberg，J.，McLaughlin，P.，Shen，D.，1998.
[0009] Association of serum rituximab (IDEC-C2B8)concentration and anti-tumor response in the treatmentof recurrent low-grade or follicular non-Hodgkin' s lymphoma. Ann. Oncol. 9,995-1001.
[0010] Beum,P. V. ,Kennedy,A. D. ,Taylor,R.P. ,2004. Three new assays for rituximab based on its immunological activity or antigenic properties !analyses of sera and plasmas of RTX-treated patients with chronic lymphocytic leukemia and other B cell lymphomas. J. Immunol. Meth. 289,97-109.
[0011] Cartron G，Blasco H，Paintaud G，Watier H，Le Guellec C. . Pharmacokinetics of rituximab and its clinical use !thought for the best use ? Crit Rev Oncol Hematol. 2007,62(1) :43-52.
[0012] Cragg，M. S.，Bayne，M. B.，Tutt，A. L.，French，R. R.，Beers，S.，Glennie，M. J.， Illidge,T. M. ,2004. A new anti-idiotype antibody capable of binding rituximab on the surface of lymphoma cells. Blood 104,2540-2542.
[0013] Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation FDA. May 2001.
[0014] Hampson G，Ward TH，Cummings J，Bayne M，Tutt AL，Cragg MS，Dive C， Illidge TM. 2010. Validation of an ELISA for the determination of rituximab pharmacokinetics in clinical trials subjects J Immunol Methods. Aug31 ；360(l-2)： 30-8.
[0015] Iacona，I.，Lazzarino，M.，Avanzini，M. A.，Rupolo，M.，Arcaini，L.， Astori，C.，Lunghi，F.，Orlandi，E.，Morra，E.，Zagonel，V.，Regazzi，M.B.，2000. Rituximab (IDEC-C2B8) !validation of a sensitive enzyme-1 inkedimmunoassay applied to a clinical pharmacokinetic study. Ther. DrugMonit. 22,295-301.
[0016] McLaughlin P, Grillo-Lopez A J，Link BK, Levy R, Czuczman MS, Williams ME，Heyman MR，Bence-Bruckler I，White CA, Cabanillas F，Jain V，Ho AD，Lister J， Wey K, Shen D, Dallaire BK. 1998. Rituximab Chimeric Anti_CD20Monoclonal Antibody Therapy for Relapsed Indolent Lymphoma ：Half of Patients Respond to a Four-Dose Treatment Program ；J Clin Oncol. 16 :2825-33.
[0017] Maloney，D. G.，Liles，T. M.，Czerwinski，D. K.，Waldichuk，C. Rosenberg，J.，Gril lo-Lopez, A. , Levy, R. ,1994. Phase I clinical trial using escalating single-dose infusion of chimeric anti_CD20 monoclonal antibody(IDEC-C2B8)in patients with recurrent B-cell lymphoma. Blood,84,2457.
[0018] Manches，0?，Lui，G.，Chaperot，L，Gressin，R.，Molens，J. P.，? Jacob MC，Sotto JJ，Leroux D，Bensa JC，Plumas J. 2003. In vitro mechanisms of action of rituximab on primary non-Hodgkin lymphomas. Blood,101 :949-954.
[0019] Tran L, Baars JW, Aarden L, Beijnen JH, Huitema AD. 2010. Pharmacokinetics of rituximab in patients with CD20positive B-cell malignancies. Hum Antibodies., 19(1) :7-13.
【发明内容】
[0020] 为了准确的检测血清药物浓度的变化，更好的分析抗CD20抗体的药代动力学特 征，本文提供了新的定量测定血清中抗CD20单克隆抗体（尤其是SCT400)浓度的ELISA方 法。
[0021] 在一些实施方案中，令人吃惊地发现所述方法不需要高倍稀释，检测抗CD20单克 隆抗体具备高特异性。在一些实施方案中，所述方法不与正常人IgG产生交叉反应。在一 些实施方案中，所述方法避免了使用单克隆抗体如mAb MB2A4检测所必需的高通量筛选、费 用昂贵和难以广泛运用等缺陷。
[0022] 因此，本申请提供了测定血清中抗CD20单克隆抗体浓度的酶联免疫吸附测定法， 所述测定法使用抗CD20单克隆抗体的F (ab') 2片段免疫动物获得的多克隆抗体作为捕获 抗体，使用IgG_F(ab' )2抗体作为检测抗体。
[0023] 在一些实施方案中，所述多克隆抗体如下获得：使用胃蛋白酶消化抗CD20单克隆 抗体，去除Fc片段（例如可通过亲和层析柱去除混合液中的Fc片段），收集F(ab' )2片 段，优选对所述F(ab' )2片段进行纯化（例如可通过超滤和采用层析柱进行纯化），然后 用于免疫动物。
[0024] 在一些实施方案中，所述免疫动物为兔。
[0025] 在一些实施方案中，在检测前对血清样品进行稀释的步骤。在一些实施方案中，所 述方法不需要高倍稀释，检测抗CD20单克隆抗体具备高特异性，例如，对样品的稀释可低 于20000倍，例如18000倍以下，17000倍以下，16000倍以下，15000倍以下，14000倍以下， 13000倍以下，12000倍以下，11000倍以下，10000倍以下，9000倍以下，8000倍以下，7000 倍以下，6000倍以下，5000倍以下，4000倍以下，3000倍以下，2000倍以下，1800倍以下， 1700倍以下，1600倍以下，1500倍以下，1400倍以下，1300倍以下，1250倍以下，1200倍以 下，1180倍以下，1150倍以下，1120倍以下，1100倍以下，1080倍以下，1050倍以下，1020倍 以下，或1000倍以下；所述稀释倍数可以在200倍以上，300倍以上，400倍以上，500倍以 上，600倍以上，700倍以上，800倍以上，850倍以上，900倍以上，950倍以上，980倍以上，或 1000倍以上。在一些实施方案中，血清样品的稀释范围可在上述范围内任意选择。
[0026] 在一些实施方案中，所述血清包括人血清。
[0027] 在一些实施方案中，所述抗⑶20单克隆抗体包括SCT400和利妥昔单抗，优选单克 隆抗体SCT400。
[0028] 在一些实施方案中，所述IgG_F(ab' )2抗体包括兔抗鼠 IgG_F(ab' )2抗体。在 一些实施方案中，IgG-Ffeb' )2抗体可以进行标记，优选所述IgG-Ffeb' )2抗体是HRP标 记的抗体。
[0029] 在一些实施方案中，所述测定法为定量测定法。
[0030] 在一些实施方案中，所述测定法的灵敏度可达0. 78ng/mL。
[0031] 在一些实施方案中，所述测定法的线性范围在I. 56ng/ml?50ng/ml范围内。
[0032] 在一些实施方案中，在0. 1%空白血清检测时，非相关人、鼠、嵌合IgG对检测结果 无影响。
[0033] 因此，在一些实施方案中，本申请提供的测定法检测抗CD20单克隆抗体具备高特 异性。在一些实施方案中，本申请提供的测定法不与正常人IgG产生交叉反应。在一些实 施方案中，本申请提供的测定法避免了使用单克隆抗体如mAb MB2A4检测所必需的高通量 筛选、费用昂贵和难以广泛运用等缺陷。
【专利附图】
【附图说明】
[0034] 图1 :血清中SCT400药物浓度测定典型标准曲线（0? 39?50ng/ml)。
[0035] 图2 :1-01受试者（250mg/m2)给药后时间血清中SCT400随时间变化的药物浓 度-时间曲线。
【具体实施方式】
[0036] 为了更加清楚的对本发明进行说明，以下通过具体实施实例对本发明的具体实施 方式进行更为详细的说明。但是应该理解，以下所述具体实施实例仅用于本发明进行示例 性说明，而非用于本发明进行任何性质限定，其中所用材料、试剂、仪器及操作条件仅为代 表性的，其并不限于所列举的情况。所属【技术领域】的技术人员通过阅读以下说明可以对本 发明做出不脱离本发明权利要求所限定的保护范围的改动和改进，这些改动和改进也处于 本发明所要求保护的范围内。
[0037] 1 ?抗体筛选：
[0038] I. 1兔抗SCT400_F(ab ' )2多抗的生产与纯化：将500 ii g胃蛋白酶 (sigma-aldrich，USA)用20mM醋酸钠缓冲液稀释好后，加入到50mgSCT400中，37°C孵育过 夜，加入2M Tris-HCl缓冲液进行终止。使用蛋白G亲和层析柱去除混合液中的Fc片段，收 集含有F(ab' )2片段的溶液，进行超滤（30KDa孔径，Miilipore，USA)。之后采用SEC-葡 聚糖凝胶200层析柱将SCT400F (ab' ) 2片段进一步纯化。
[0039] 纯化后的SCT400F(ab' )2片段皮下注射入新西兰大白兔进行免疫，从而产生 抗-SCT400F(ab' )2抗体。收集兔血清，用蛋白G亲和层析柱进行纯化后，进行抗原亲和层 析。为了减少兔抗体与人免疫球蛋白的交叉反应，采用正常人血清来源的人免疫球蛋白偶 联的亲和层析柱进行纯化。经SDS-PAGE检测兔抗体纯度后，0D280测定蛋白质含量。
[0040] I. 2HRP标记的兔抗鼠 IgG-F(ab2片段：HRP标记的兔抗鼠 IgG-F(ab2片段 购自Jackson Immuno Research,该试剂与人IgG抗体交叉反应较低。
[0041] 1. 3流式细胞术：采用流式细胞术检测SCT400及利妥昔单抗与细胞表面的⑶20 抗原结合是否具有差异。制备3管Daudi细胞,每管含有IX IO6个细胞,一管加入I ii g SCT400, 一管加入I ii g利妥昔单抗，剩余一管加入PBS作为阴性对照。4°C孵育20分钟，用 ImL含有0. 5 % BSA的PBS洗涤细胞，800rpm离心5分钟。之后采用FITC标记的鼠抗人IgG Fc二抗（义翘神州生物技术有限公司提供）在4°C孵育20分钟。洗涤三次后，加入500 UL 0. 5% BSA-PBS重悬细胞，采用BD FACS Calibur流式细胞仪进行分析。
[0042] 2?方法验证与结果
[0043] 2. 1.药品与试剂：标准品：SCT400,由神州细胞工程有限公司提供。规格： 50mg (5ml)/瓶，批号：20120301。包被液（pH 9. 6碳酸盐缓冲液）；磷酸盐缓冲液（pH7. 4); 洗涤液（磷酸盐缓冲液-〇. 05% Tween 20, pH7. 4);封闭液（含2%牛血清白蛋白的洗涤 液）；二抗稀释液（0.5%牛血清白蛋白-PBS-Tween 20，pH7. 4);样品稀释液（0. 1%牛血清 白蛋白-PBS-Tween20，pH 7. 4) ;0. 1%人混合血清稀释液；显色液；终止液（2M硫酸）；包被 抗体：即兔抗SCT400-F(ab' )2多抗（0. 14mg/m2,批号：PH05SE0501);检测抗体：即辣根过 氧化物酶标记的兔抗鼠 IgG-F(ab' )2(0. 5mg/ml，批号：96850)。
[0044] 2. 2设备与耗材：酶标仪：型号Multiskan GO, Thermo公司产品；涡旋混匀器：型 号QL-901，海门其林贝尔仪器制造有限公司产品；Eppendorf单道、12道移液器；高吸附96 孔酶标板：Nunc公司产品等。
[0045] 2. 3ELISA测定操作步骤：用包被液稀释兔抗SCT400-F(ab' )2多抗至750ng/ml， 以100 yl/孔加至96孔酶标板内，4°C放置过夜。洗涤液300ul/孔，洗板3次。用含保护 剂的封闭液以300 iU/孔加至板内，室温放置1小时。干燥及真空包装：室温4小时后，于 吸水纸上拍干酶标板，之后将酶标板正向置于通风橱中干燥1小时。取出后用铝箔袋真空 包装（每袋一板，加一袋干燥剂）。置4°C保存。将预包板从4°C取出后，300ul/孔，洗板 3次。将空白对照、标准品、质控样品及稀释好的待检样品均以IOOiU/孔加至板内，室温 放置2小时。洗板5次，每次都需要在滤纸上拍干。再用二抗稀释液将HRP标记的兔抗鼠 IgG-F (ab')2抗体稀释4000倍，以100 iU/孔加至板内，室温放置1小时。洗板5次，每次 都需要在滤纸上拍干。以100 Ul/孔加入临时配制的显色液，室温放置20min。以50 iil/ 孔加入终止液终止反应。混匀后立即将酶标板放入酶标仪中，选择450nm为测定波长测定 吸光度。
[0046] 2. 4方法学验证
[0047] 参照FDA及CFDA生物样本检测指导原则，方法学验证包括方法的灵敏度、特异性、 标准曲线与线性范围、精密度与准确度、样品稳定性、提取回收率、基质效应、稀释效应、方 法学质控等方面。
[0048] 2. 4. 1标准曲线、线性范围、质控样品和定量下限
[0049] 标准曲线是采用含0. 1%空白人血清的样品稀释液稀释SCT400标准品，配制不 同浓度的SCT400,使标准曲线各浓度点的终浓度分别为50、25、12. 5、6. 25、3. 125、1. 56ng/ ml, LLOQ为I. 56ng/ml，ULOQ为50ng/ml标准曲线外带一个Ong/ml的浓度点，用于标准曲 线的本底扣除参比值。QC高、中、低浓度分别为：40、12. 5和3. 125ng/ml。
[0050] 以0? 1 %血清中配置的SCT400的梯度浓度（取log)为横坐标，浓度对应的0? D值 为纵坐标，采用四参数方法￥ = \*(仏142)八乂42)-1)八（1/?进行回归计算，所得回归 方程即为标准曲线。定量下限是标准曲线上的最低浓度点。标准曲线上的低浓度点误差值 不得超过20 %，中、高浓度点的误差值不超过15 %，且至少75 %的浓度点在合格范围内。
[0051] 典型的标准曲线图如图1所示。
[0052] 2. 4. 2分析方法的准确度和精密度
[0053] 取0. 1%空白人血清的样品稀释液稀释，制备高、中、低三个浓度点的QC样品40， 12. 5和3. 125ng/ml，每个浓度平行五个样品测定，依法与标准曲线同批测定，以同批的标 准曲线计算QC样品浓度。连续进行三批试验，根据QC样品的结果，求算批内及批间的精密 度和准确度。结合三批试验数据进行方法准确度与精密度的计算。精密度要求高、中浓度 点的批内和批间相对标准偏差（RSD% )不超过15%，低浓度点的批内和批间相对标准偏差 (RSD%)不超过20%。高、中浓度点准确度（RE%)的均值应在理论值的±15%以内，低浓 度点的均值在±20%以内。结果见表1。
[0054] 表1、检测0. 1 %血清样品中SCT400分析方法准确度和精密度
[0055]
【权利要求】
1. 测定血清中抗CD20单克隆抗体浓度的酶联免疫吸附测定法，所述测定法使用 抗CD20单克隆抗体的F(ab ' )2片段免疫动物获得的多克隆抗体作为捕获抗体，使用 IgG-F (ab' ) 2抗体作为检测抗体。
2. 权利要求1所述的测定法，其中所述多克隆抗体如下获得：使用胃蛋白酶消化抗 ⑶20单克隆抗体，去除Fc片段，收集F(ab' )2片段，优选对所述F(ab' )2片段进行纯化， 然后用于免疫动物，优选兔。
3. 权利要求1-2任一项所述的测定法，其中包括在检测前对血清样品进行稀释的步 骤，优选稀释低于20000倍，例如稀释200至18000倍，300至15000倍，400至12000倍，500 至 10000 倍，600 至 8000 倍，700 至 6000 倍，800 至 3000 倍，900 至 2000 倍，950 至 1500 倍， 980至1200倍等。
4. 权利要求1-3任一项所述的测定法，其中所述血清包括人血清。
5. 权利要求1-4任一项所述的测定法，其中所述抗⑶20单克隆抗体包括SCT400和利 妥昔单抗，优选SCT400。
6. 权利要求1-5任一项所述的测定法，其中所述IgG-F(ab' )2抗体包括兔抗鼠 I gG-F (ab '）2抗体，优选所述I gG-F (ab '）2抗体是HRP标记的抗体。
7. 权利要求1-6任一项所述的测定法，其中所述测定法为定量测定法。
8. 权利要求1-7任一项所述的测定法，其中所述测定法的灵敏度达0. 78ng/mL。
9. 权利要求1-8任一项所述的测定法，其中所述测定法的线性范围在1. 56ng/ml? 50ng/ml范围内。
10. 权利要求1-9任一项所述的测定法，其中在0. 1%空白血清检测时，非相关人、鼠、 嵌合IgG对检测结果无影响。
【文档编号】G01N33/577GK104391114SQ201410640266
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月13日 优先权日:2014年11月13日
【发明者】石远凯, 谢良志, 韩晓红, 盖文琳, 宋媛媛, 李丹, 王寅 申请人:中国医学科学院肿瘤医院, 神州细胞工程有限公司