一种奶牛泌乳中乙草胺含量消退的预测方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种奶牛泌乳中乙草胺含量消退的预测方法及应用，属于食品安全【技术领域】。本发明通过对乙草胺超标奶牛所分泌的牛乳进行乙草胺含量测定，对所得数据进行统计分析获得拟合方程，再对方程进行验证后获得预测方法，利用所得预测方程来预测乙草胺超标奶牛泌乳中的乙草胺含量消退时间。该方法该方法对牛乳中乙草胺浓度的预测值，相对误差在5％以内，准确率高达95.00～98.52％，适用于预测乙草胺超标奶牛在泌乳过程中乙草胺浓度消退水平及消退至限量浓度以下所需时间，减轻了企业人力、物力的投入，节约成本、减少损失，同时也为乳品的安全提供有力可靠的保证。
【专利说明】一种奶牛泌乳中乙草胺含量消退的预测方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种奶牛泌乳中乙草胺含量消退的预测方法及应用，属于食品安全技 术领域。
【背景技术】
[0002] 牛奶是一种营养价值丰富、接近完善的健康食品，也是食品加工中非常重要的原 料之一。近年来，随着人们生活水平的不断提高，牛奶的人均消费量也大幅度增加，人们越 来越重视牛奶的安全问题。而农药残留是影响牛奶的安全因素之一，国内外大量毒理学试 验研宄表明，长期暴露农药可能引起多种医学问题，例如癌症、毒害神经、生殖危害、内分泌 干扰等，这些危害通常属于长时期、微剂量、慢性细微毒性效应。所以发展安全牛奶应重视 牛奶中的农药残留问题。
[0003] 乙草胺，别称为2-乙基-6-甲基-N-乙氧基甲基-α-氯代乙酰替苯胺，具有不易 溶于水、易溶于有机溶剂、性质稳定、不易挥发和光解的性质，是1971年由美国孟山都公司 开发的一种芽前选择性酰胺类除草剂，用于防除玉米中一年生禾本科杂草和某些一年生阔 叶杂草，世界上最常用的除草剂之一。美国环保局将其规定为Β-2类致癌物，规定在1个月 监测期内，地下水中乙草胺残留浓度不得超过〇.lg/L。欧盟规定牛乳（cattlemilk)中乙 草胺的最大残留限量（MRL)为0. 01mg/kg。
[0004] 随着农药的广泛使用，日常生活中奶牛因意外摄入或接触乙草胺污染投入品后， 会引起所产牛乳中乙草胺含量超标。当奶牛因意外摄入或接触乙草胺污染投入品使所泌牛 乳中乙草胺含量超过欧盟限量标准（O.Olmg/kg)时，奶牛所泌牛乳无法作为原料乳进行生 产，但是奶牛成本较大，将其淘汰企业损失较大，对于这种泌乳中乙草胺含量超标，但并未 达到中毒水平的奶牛仍有其商业价值，可以将其隔离饲养，等待奶牛通过自身代谢将乙草 胺排出，直至其所分泌的牛乳中乙草胺含量低于欧盟限量标准后才能再次作为原料乳进行 生产，但是为了监测被隔离奶牛牛乳中乙草胺含量的消退水平及消退至欧盟限量值以下的 时间，就必须对奶牛所分泌的牛乳进行实时检测，增加了人力、物力及企业经营成本，增大 了企业损失。因此，现有技术急需一种能够预测牛乳中乙草胺含量消退的方法，以减轻企业 人力、物力的投入，节约成本、减少损失，同时也为乳品的安全提供有力可靠的保证。
【发明内容】
[0005] 为解决现有技术的不足，本发明提供了一种奶牛泌乳中乙草胺含量消退的预测方 法及应用，采用的技术方案如下：
[0006] 本发明的目的在于提供一种奶牛泌乳中乙草胺含量消退的预测方法。该方法是收 集乙草胺超标奶牛所分泌的牛乳，检测牛乳中乙草胺的初始浓度，对乙草胺超标奶牛隔离 饲喂管理，按照采样方案采集隔离奶牛所分泌的牛乳，对所采集的牛乳进行乙草胺含量的 测定，对所得乙草胺含量数据进行统计分析获得拟合方程，再对拟合方程进行验证后获得 预测方法，利用所得预测方程预测乙草胺超标奶牛泌乳中的乙草胺含量消退时间；所述预 测方程为：Y= 0.0368 · (Χ+0.4277Γ°_664°;其中，X为隔离后天数，Y为牛乳中乙草胺的质量 浓度；所述方法的步骤如下：
[0007] 1)收集乙草胺超标奶牛所分泌的牛乳，检测牛乳中乙草胺的初始浓度；
[0008] 2)对乙草胺超标奶牛隔离饲喂管理，按照采样方案采集隔离奶牛所分泌的牛乳；
[0009] 3)对所采集的牛乳进行样品前处理，检测牛乳中乙草胺含量；
[0010] 4)对检测数据进行统计分析，获得得到拟合方程，对拟合方程进行验证后获得预 测方程
[0011] 5)所述预测方程为：Y= 0. 0368 · (Χ+0. 4277)-°·664°，其中，X为隔离后天数，Y为牛 乳中乙草胺的质量浓度；
[0012] 6)利用预测方程预测奶牛泌乳中乙草胺浓度消退时间。
[0013] 所述步骤1)中乙草胺超标奶牛为所分泌的牛乳中乙草胺含量超过0. 01mg/kg的 非中毒奶牛。
[0014] 所述步骤1)中奶牛品种为荷斯坦奶牛，所述初始浓度不高于0. 02878mg/kg。
[0015] 所述步骤2)中采样方案为：刚隔离奶牛采集的乳样记为第1天，采样20天，每天 采样一次，每次所采样品来自当天7点、15点和23点所榨乳得混合乳。
[0016] 优选地，步骤3)所述检测牛乳中乙草胺的含量，是采用气相色谱-质谱联用法进 行检测。
[0017] 步骤4)所述统计分析，是对乙草胺含量数据进行非线性拟合。
[0018] 所述方法的具体步骤为：1)收集乙草胺含量在0. 01-0. 02878mg/kg的超标牛乳样 品，并测定初始浓度；2)对乙草胺超标奶牛隔离饲喂管理，按照采样方案采集隔离奶牛所 分泌的牛乳；3)所述采样方案为：刚隔离奶牛采集的乳样记为第1天，采样20天，每天采样 一次，每次所采样品来自当天7点、15点和23点所榨乳得混合乳；
[0019] 4)对所采集的牛乳进行样品前处理，采用气相色谱-质谱联用法检测乙草胺的含 量；
[0020] 5)对检测数据进行非线性拟合获得拟合方程，再对拟合方程进行验证获得预测方 程；
[0021] 所述预测方程为：Y= 0. 0368 · (X+0. 4277)-° 664°;其中，X为隔离后天数，Y为牛， 乳中乙草胺的质量浓度；
[0022] 6)利用步骤4)所得的预测方程预测乳中乙草胺超标奶牛在泌乳过程中乙草胺浓 度的消退水平和时间。
[0023] 本发明中奶牛为荷斯坦奶牛，体重为550?620kg，年龄2?4周岁，奶牛除所产牛 乳中乙草胺含量超标外，体况良好，无其他疾病，且未出现乙草胺中毒症状。
[0024] 本发明所述的方法可以应用于预测乙草胺超标奶牛在泌乳过程中乙草胺浓度消 退水平及消退至限量浓度以下所需时间。
[0025] 本发明对发现乳中乙草胺超标奶牛进行隔离管理，对每天榨乳的样品进行采集、 储藏等，为了达到预期良好效果，构建了大量的样本信息，保证了所采样品准确性，防止了 非监测乳混入或样品间的交叉污染情况的发生。本发明对所采乳中乙草胺的检测准确度 高，方法标准一致，同一人检测完成所有样本，以减少系统误差。本发明利用IstOpt数学分 析软件对采集后样品检测的结果进行统计分析，可对结果曲线进行非线性拟合，需要对拟 合出的曲线进行有效的筛选评估，并进行大量的检测及计算验证，以筛选出最优的曲线拟 合方程。本发明有益效果：
[0026] 本发明所述方法只需已知奶牛所产乳中乙草胺超标的初始浓度，即可通过方程预 测此后每一天奶牛所产乳中乙草胺的浓度，无需对乳中乙草胺超标的奶牛每天进行奶样的 采集、检测，操作简便，准确度高。减少了因需要对奶牛所产乳中乙草胺浓度的监测而消耗 的人力成本，包括奶样的采集、贮存、检测等，物力成本包括收集牛奶样品所用的耗材成本， 检测乳中重金属所用的实验方法的试剂、耗材、仪器分析等诸多成本。同时本发明所述方法 是一种极为省时高效的牛乳乙草胺浓度实时监测方法，预测准确性高，解决了传统监测方 法用时比较长、监测结果滞后性等问题。此外，本发明所述方法对奶牛所产乳中乙草胺浓度 消退的预测，为原料乳中乙草胺风险因子的监测提供了有效手段，为乳品安全提供了可靠 的保证。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0028]
[0029]
[0030] 实施例1:案例发现
[0031] 东北地区某牧场发现了一批荷斯坦奶牛的牛乳中可检测出乙草胺农药，超过欧盟 规定限量值（〇. 〇lmg/kg)。选取40头乙草胺超标奶牛进行单独栏放、隔离饲喂，饲养管理标 准相同，每天饲喂两次基础日粮，自由饮水，且能够满足奶牛日常的营养需求。采用榨乳机 榨乳，每天于7点、15点、23点共榨乳三次，进行为期20d的乳样采集工作。每天按照三个榨 乳时间各采样一次，将采集好的三次样品按照4:3:3(奶牛一天中三个时间的产奶量之比） 的比例混匀于50mL离心管中，编号，立即放到_20°C的冰箱里，作为检测样品。采取单独榨 乳的方式，榨乳所得牛奶立即弃掉，不能混入正常牛奶中，以保证安全。
[0032] 实施例2:奶样中乙草胺含量的检测
[0033] 参照实施例1进行样品收集。
[0034] (1)样品前处理
[0035] a.提取
[0036] 临用前，将奶样从_20°C的冰箱中取出，放在室温下解冻，然后用漩涡振荡器混匀， 准确称取2.Og奶样（精确至0·Olg)于50mL离心管中，加入0· 5g氯化钠、10.OmL乙腈，漩 涡震荡5min左右，以4000r/min离心5min，再准确移取5.OmL上清液于玻璃试管中，40°C氮 吹至干，待净化。
[0037] b.净化
[0038] 将所得样品用LOmL丙酮定容，漩涡均匀后转移到装有基质分散剂（0. 15g无水 硫酸儀、〇.15gCleanertPSA、0.02gCleanertPestiCarb)的2mL离心管中，游祸均勾，以 15000r/min离心lOmin，静止片刻，取适量上清液供气相色谱-质谱联用仪测定。
[0039] (2)气相色谱-质谱联用法检测乙草胺含量
[0040] 利用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS)建立了牛乳中乙草胺检测方法，能够实现 牛乳中乙草胺的定性和定量的要求。
[0041] 气相色谱条件：气相色谱仪：Agilent 7890A;色谱柱：HP-5MS， 30mX0.25ymX250 ym(内径）；色谱柱温度：8(TC保持2min，然后以15°C /min升温至 200°C，再以30°C /min升温至270°C保持IOmin ;进样量：1 yL ;进样方式：无分流模式；进 样口温度：250°C ;载气：氦气，纯度彡99. 999%，流速：lmL/min。如表1所示：
[0042] 质谱条件：质谱仪：Agilent5975C;接口温度：280°C;电离方式：EI;电子轰击： 70eV;离子源温度：230°C;四级杆温度：150°C;质谱扫描技术：选择离子监测；选择监测离 子：定量离子223,定性离子146、162、269(丰度比63 :100 :75 :9);溶剂延迟：3min。如表2 所示：
[0043] 表1气相色谱条件
【权利要求】
1. 一种奶牛泌乳中乙草胺含量消退的预测方法，其特征在于：收集乙草胺超标奶牛所 分泌的牛乳，检测牛乳中乙草胺的初始浓度，对乙草胺超标奶牛隔离饲喂管理，按照采样方 案采集隔离奶牛所分泌的牛乳，测定所采集的牛乳样品中的乙草胺含量，对所得乙草胺含 量数据进行统计分析获得拟合方程，再对拟合方程进行验证后获得预测方程，利用所得预 测方程预测乙草胺超标奶牛泌乳中的乙草胺含量消退时间； 所述预测方程为：Y = 0. 0368 ? (X+0. 4277r°_664°;其中，X为隔离后天数，Y为牛乳中乙 草胺的质量浓度。
2. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下： 1) 收集乙草胺超标奶牛所分泌的牛乳，检测牛乳中乙草胺的初始浓度； 2) 对乙草胺超标奶牛隔离饲喂管理，按照采样方案采集隔离奶牛所分泌的牛乳； 3) 对所采集的牛乳进行样品前处理，检测牛乳中乙草胺的含量； 4) 对检测数据进行统计分析，获得得到拟合方程，对拟合方程进行验证后获得预测方 程； 所述预测方程为：Y = 0. 0368 ? (X+0. 4277r°_664°;其中，X为隔离后天数，Y为牛乳中乙 草胺的质量浓度； 5) 利用预测方程预测奶牛泌乳中乙草胺浓度消退时间。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)所述乙草胺超标奶牛，为所分泌的 牛乳中乙草胺含量超过〇. Olmg/kg的非中毒奶牛。
4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)所述奶牛品种为荷斯坦奶牛。
5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)所述初始浓度不高于0. 02878mg/ kg〇
6. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)所述采样方案，刚隔离奶牛采集的 乳样记为第1天，采样20天，每天采样一次，每次所采样品来自当天7点、15点和23点所榨 乳得混合乳。
7. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3)所述检测牛乳中乙草胺的含量，是 采用气相色谱-质谱联用法进行检测。
8. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤4)所述统计分析，是对乙草胺含量数 据进行非线性拟合。
9. 根据权利要求2所述方法，其特征在于，具体步骤为： 1) 收集乙草胺含量在0. 01-0. 〇2878mg/kg的超标牛乳样品，并测定初始浓度； 2) 对乙草胺超标奶牛隔离饲喂管理，按照采样方案采集隔离奶牛所分泌的牛乳； 所述采样方案为：刚隔离奶牛采集的乳样记为第1天，采样20天，每天采样一次，每次 所采样品来自当天7点、15点和23点所榨乳得混合乳； 3) 对所采集的牛乳进行样品前处理，采用气相色谱-质谱联用法检测乙草胺的含量； 4) 对检测数据进行非线性拟合获得拟合方程，再对拟合方程进行验证获得预测方程； 所述预测方程为：Y = 0. 0368 ? (X+0. 4277r°_664°;其中，X为隔离后天数，Y为牛乳中乙 草胺的质量浓度； 5) 利用步骤4)所得的预测方程预测乳中乙草胺超标奶牛在泌乳过程中乙草胺浓度的 消退水平和时间。
10.权利要求1-9所述的方法应用于预测乙草胺超标奶牛在泌乳过程中乙草胺浓度消 退水平及消退至限量浓度以下所需时间。
【文档编号】G01N30/88GK104483426SQ201410705862
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年11月27日 优先权日:2014年11月27日
【发明者】姜毓君, 满朝新, 李琳瑶, 田成新, 邓宇, 刘泳麟, 费鹏, 赵玥明, 刘少敏, 李婷 申请人:黑龙江省乳品工业技术开发中心