-atp酶活性的方法
【专利摘要】本发明公开了一种准确测定花鳗鲡V型-H+-ATP酶(VHA)活性的方法。本发明是通过测定酶促反应中释放的无机磷量来测定ATP酶的活力，将花鳗鲡组织样品前处理后，测定组织匀浆的蛋白浓度；以组织匀浆为ATP酶源进行酶促反应；通过测定酶促反应中释放的无机磷量来计算出ATP酶的活力；反应中设空白组、标准组、对照组和测定组。本发明具有准确、快捷、经济的特点，而且更换缓冲液后可运用于其他鱼类，适用于科研单位、技术推广站及企业检测鱼类VHA酶活力，为鱼类渗透压调节机制研究提供基础资料，并对扩大花鳗鲡在盐碱地、沿海滩涂及咸淡水中的养殖生产具有指导价值。
【专利说明】一种准确测定花鳗鲡V型-H+-ATP酶活性的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及鱼类酶学检测【技术领域】，具体涉及一种准确测定花鳗麵V型-H+-ATP 酶（Vacuolar-Type_H+-ATPase)活性的方法。
【背景技术】
[0002] 花饅麵（Anguillamarmorata)是一种典型的降河性洄游鱼类，性成熟后便由江河 的上、中游移向下游，群集于河口处入海，到远洋中去产卵繁殖。近年来，由于过度捕捞、环 境污染、拦河建坝等人类活动加剧，花鳗麵的分布海域在逐渐缩小，自然资源明显减少，我 国已将其列为二级保护动物。花鳗麵不但肉质好，营养价值高，素有"水中人参"之称，而且 有药用价值，是优质食用鱼类，该鱼市场价格是日本鳗麵、欧洲鳗麵的3倍，市场前景广阔。 目前，海南、福建、广东等地积极发展花鳗麵人工养殖业，但是由于花鳗麵的苗种完全依赖 于天然苗种的捕捞，而且培育成活率不高，故而极大地影响了养鳗产业的健康持续发展。因 此，为了有效地提高花鳗麵苗种的培育成活率和扩大苗种的养殖范围，保护日益稀少的花 鳗麵苗种资源变得重要和紧迫。盐度作为洄游性鱼类的一个非常重要的非生物因素，它与 鳗麵的生长、存活、洄游以及耗氧率等一系列生态、生理过程密切相关。当务之急是加强花 鳗麵应对环境盐度变化的适应性调节机制的基础研宄，特别是对花鳗麵适应盐度变化的渗 透调节机制进行系统研宄。
[0003] 在真核生物中，V型-H+-ATP酶（Vacuolar-Type_H+-ATPase或H+_ATPase)是一种 由ATP驱动的质子泵，存在于细胞质膜和多种细胞内膜系统中，包括溶酶体、核内体、高尔 基体囊泡、液泡、微泡等。该离子泵通过ATP水解产生的能量将质子从胞质中泵进细胞器腔 内从而介导细胞内膜的酸化、胞浆内的PH值变化等。
[0004] 目前，许多学者对于鱼类渗透压调节酶的相关研宄均集中在Na+/K+-ATP酶（NKA) 测定，而对于鱼类V型-H+-ATP酶（Vacuolar-Type-H+-ATPase，VHA)活性检测未见相关报 道。VHA酶活力作为一个重要的生理指标，在鱼类盐度适应过程中受到盐度的影响，因此通 过检测VHA酶活力能够反应出花鳗麵幼鳗对不同盐度变化的适应情况，可以进一步探讨其 在花鳗麵幼鳗的渗透压调节过程中起到的作用，阐明花鳗麵幼鱼入海洄游过程中的渗透压 调节规律，为其渗透压调节机制研宄提供基础资料，并可以为扩大花鳗麵在盐碱地、沿海滩 涂及咸淡水中的养殖生产具有指导价值。
【发明内容】
[0005] 本发明的基本原理：ATP酶（Adenosinetriphosphatase)可催化ATP水解生成 ADP及无机磷的反应，这一反应可释放出大量能量，以供生物体进行各项需能生命过程。本 发明通过测定酶促反应中释放的无机磷量来测定ATP酶的活力。
[0006] 针对以上技术现状，本发明所要解决的技术问题是提供一种准确、高效的测定花 鳗麵V型-H+-ATP酶活性的方法：是将花鳗麵组织样品前处理后，测定组织匀浆的蛋白浓 度；以组织匀浆为ATP酶源进行酶促反应；通过测定酶促反应中释放的无机磷量来计算出 ATP酶的活力；反应中设空白组、标准组、对照组和测定组。
[0007] 本发明中测定无机磷量的方法是：利用在酸性条件下，无机磷可与钼酸铵作用生 成磷钼酸铵，并被氯化亚锡还原成蓝色的磷钼蓝的原理，在酶促产物中加入钼酸铵、氯化亚 锡，然后用分光光度计检测各组的吸光度值（OD值），由此测定磷的含量。
[0008] 本发明中，ATP酶的活力的计算方法是：组织Vacuolar-Type_H+-ATPase活力（U/ mgprot)=(测定OD值-对照OD值）/ (标准OD值-空白OD值）*标准品浓度（0? 02ymol/ mL)*2*7/待测样本蛋白浓度（mgprot/mL)。
[0009] 具体包括以下5个步骤：1、花鳗麵组织样品前处理；2、蛋白浓度测定；3、酶促反 应；4、定磷；5、V型-H+-ATP酶活性定量计算。
[0010] 所述步骤1，花鳗麵组织样品前处理：取出花鳗麵待测组织，按重量（g):体积（mL) =1:9的比例，加入9倍体积的缓冲液，在冰水浴条件下机械匀浆，然后在4°C条件下，以 5000转/分的转速离心lmin，取上清液（即浓度为10%的匀浆上清液）。
[0011] 所述缓冲液配方为：150mmol/ ?L鹿糖，lOmmol?/LEDTANa2, 50mmol/ ?L咪挫， 0. 1 %脱氧胆酸钠。
[0012]所述步骤2,蛋白浓度测定：使用考马斯亮蓝试剂盒测定组织蛋白浓度。测定组织 蛋白后，组织匀浆的蛋白质浓度用缓冲液稀释至1. 3mg/mL以下。
[0013] 所述考马斯亮蓝法测定组织蛋白浓度时组织匀浆的浓度一般为0. 5%-2%。
[0014]所述步骤3,酶促反应：取两个1. 5mLEP管分别标记为对照管和测定管，分别 加入 10yL样本，lOOyLATPNa2(3.6mM)，70yLNaCl(125mM)，70yLKCl(75mM)，50yL MgCl2(7. 5mM)，然后向对照管加入50yL巴弗洛霉素Al(40ymol? /L)，向测定管中加入 50yL双蒸水，混匀后在37°C水浴锅中准确反应30min，然后在冰浴条件下反应10min，用来 终止反应。
[0015] 所述步骤4,定磷：另取两个1. 5mLEP管分别标记为空白管和标准管，向空白管、 标准管、对照管、测定管分别加入lmL钼酸铵硫酸溶液、0. 35mL二氯化锡溶液，然后向空白 管加入0. 3mL双蒸水、向标准管加入0. 3mL0. 02ymol/mL磷标准液（mL)、向对照管和测定 管加入0. 3mL上述步骤3中的酶促反应液，混匀后室温静置反应10min后，使用分光光度计 在660nm处，lcm光径条件下检测各管吸光度值。
[0016] 所述0. 02ymol/mL磷标准液配制方法为：称取无水的磷酸二氢钾2. 7218g溶于 1L双蒸水混匀，含磷0. 02ymol/mL;所述钼酸铵硫酸溶液配制方法为：称取2. 5g钼酸铵溶 于15mL双蒸水中，另将28mL浓硫酸加入47mL双蒸水中，冷却后将钼酸铵溶液倒入硫酸溶 液中并稀释至l〇〇mL混匀；所述二氯化锡溶液配制方法为：称取lg二氯化锡于小烧杯中， 加入2mL浓盐酸加热至溶解，再加入18mL双蒸水混匀，使用时按二氯化锡溶液：双蒸水= 1:4的比例稀释。
[0017] 所述步骤5,计算V型-H+-ATP酶活性：组织V型-H+-ATP酶活力（U/mgprot)= (测定0D值-对照0D值）八标准00值-空白00值）*标准品浓度（0.02^111〇1/1^)*2*7/ 待测样本蛋白浓度（mgprot/mL)。
[0018] 本发明的有益效果：
[0019] 1、能准确测定花鳗麵V型-H+-ATP酶活性，为鱼类渗透压调节机制研宄提供基础 资料，并对扩大花鳗麵在盐碱地、沿海滩涂及咸淡水中的养殖具有指导价值。
[0020] 2、本检测方法具有准确、快捷、经济的特点，而且更换缓冲液后可运用于多种鱼 类，适用于科研单位、技术推广站及企业检测鱼类VHA酶活力。
【具体实施方式】
[0021] 本发明具体检测花鳗麵V型-H+-ATP酶活力实例如下，具体参数为说明本发明技 术方案所需，不应理解为对本发明保护范围的限制。
[0022] 1仪器与材料
[0023] 1. 1 仪器
[0024] 电子天平、台式离心机、水浴锅、分光光度计。
[0025] 1.2药品与试剂
[0026] 蔗糖、EDTANa2 (乙二胺四乙酸二钠）、咪唑、脱氧胆酸钠、巴弗洛霉素A1规格 100yg(南京丁贝生物科技有限公司）、ATPNa2、氯化钠、氯化钾、氯化镁、无水的磷酸二氢 钾、钼酸铵、浓硫酸、二氯化锡、浓盐酸、双蒸水。
[0027] 1. 3实验材料人工养殖花鳗麵（体长10. 95 ±0. 94cm，体重1. 99 ±0. 78g)
[0028] 2实验方法
[0029] 2. 1试剂配制
[0030] 缓冲液：称取蔗糖25. 65g配制成200mL溶液，浓度为375mmol/ ?L;称取EDTA Na21. 86g配制成100mL溶液，浓度为50mmol/ ?L;称取咪唑1. 7g配制成100mL溶液，浓度 为250mmol/L;称取脱氧胆酸钠0. 5g配制成100mL溶液，质量分数为0. 1 % ;四种溶液混合 在一起，g卩为缓冲液，体积为500mL。
[0031] 巴弗洛霉素A1 :质量为100yg，加入lOOyL双蒸水配制成浓度为1605ymol/L的 溶液，然后取其中70yL将其浓度稀释成280ymol/ ?L，获得溶液体积400yL。
[0032] ATPNa2:称取 0. 76gATPNa2粉末配制成 100mL溶液，浓度为 12. 6mmol/L。
[0033] NaCl溶液：称取3. 66gNaCl配制成100mL溶液，浓度为625mmol/L。
[0034] KC1溶液：称取2. 79gKCl配制成100mL溶液，浓度为375mmol/L。
[0035] MgCl2溶液：称取 1. 07gMgCl2配制成 100mL溶液，浓度为 52. 5mmol/L。
[0036] 0. 02ymol/mL磷标准液配制：称取无水的磷酸二氢钾2. 7218g溶于1L双蒸水混 勾，含磷 0? 02ymol/mL。
[0037] 钼酸铵硫酸溶液配制：称取2. 5g钼酸铵溶于15mL双蒸水中，另将28mL浓硫酸加 入47mL双蒸水中，冷却后将钼酸铵溶液倒入硫酸溶液中并稀释至100mL混匀。
[0038] 二氯化锡溶液配制：称取lg二氯化锡于小烧杯中，加入2mL浓盐酸加热至溶解，再 加入18mL双蒸水混匀，使用时按1:4稀释。
[0039] 2. 2花鳗麵鳃组织处理：
[0040] 试验设3个盐度梯度，即淡水对照组（盐度0)，咸淡水（盐度10)以及海水组（盐 度25)。每个梯度设置3个平行组，每个平行组30尾幼鳗。幼鳗转移到淡水中后，先取淡 水中的花鳗麵幼鳗鳃组织作为对照组实验材料，之后每天升高2%。的趋势逐步达到咸淡水 (盐度10组）和海水组（盐度25组）。实验开始后，分别在lh，3h，6h，12h，24h，48h，96h 和15天时间段取咸淡水和海水组的花鳗麵鳃组织，每平行组随机取3尾。将取出的鳃组织 置于离心管中，称量离心管中的鳃组织，各组的组织重量在0.4-0. 7g范围内，按重量（g): 体积（mL) = 1:9的比例，即加入360yL-630yL的缓冲液，在冰水浴条件下进行机械匀浆， 4°C的条件下5000转/分，共离心lmin，然后取其上清液（即10%的匀浆上清液），再用缓 冲液10倍稀释成1%，同时用考马斯亮蓝试剂盒测定组织蛋白。
[0041] 2. 3酶促反应：
[0042] 按下表的反应体系1将溶液加入EP管中混匀，在37°C水浴锅中准确反应30min， 然后冰浴lOmin终止反应，最后取上清定磷。
【权利要求】
1. 一种准确测定花鳗麵V型-H+-ATP酶（VHA)活性的方法，其特征在于：将花鳗麵组织 样品前处理后，测定组织匀浆的蛋白浓度；以组织匀浆为ATP酶源进行酶促反应；通过测定 酶促反应中释放的无机磷量来计算出ATP酶的活力；反应中设空白组、标准组、对照组和测 定组。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，测定无机磷量的方法是：在酸性条件下， 无机磷可与钼酸铵作用生成磷钼酸铵，并被氯化亚锡还原成蓝色的磷钼蓝，使用分光光度 计在检测各组的吸光度值（0D值），由此测定磷的含量。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，ATP酶的活力的计算方法是：组织 Vacuolar-Type-H+-ATPase 活力（U/mg prot)=(测定 0D值-对照 0D值）/(标准0D值-空 白0D值）*标准品浓度（0. 02 ymol/mL)*2*7/待测样本蛋白浓度（mgprot/mL)。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤： A、 花鳗麵组织样品前处理：用眼科剪取出花鳗麵待测组织，准确称取样品重量，按重量 (g):体积（mL) = 1:9的比例，加入9倍体积的缓冲液，在冰水浴条件下机械匀浆，然后在 4°C条件下，以5000转/分的转速离心lmin，取上清液，即浓度为10%的组织匀浆； B、 蛋白浓度测定：使用考马斯亮蓝试剂盒测定组织蛋白浓度；测定组织蛋白后，组织 匀浆的蛋白质浓度用缓冲液稀释至1. 3mg/mL以下； C、 酶促反应：取两个1. 5mLEP管分别标记为对照管和测定管，分别加入10 y L组织匀浆 样本，lOOyL ATP Na2,70yL NaCl，70yL KCl，50yL MgCl2，然后向对照管加入50yL 巴弗 洛霉素 A1，向测定管中加入50 y L双蒸水，混匀后在37°C水浴锅中准确反应30min，然后终 止反应； D、 定磷：另取两个EP管分别标记为空白管和标准管，向空白管、标准管、对照管、测 定管分别加入钼酸铵硫酸溶液、二氯化锡溶液，然后向空白管加入双蒸水、向标准管加 入磷标准液（mL)、向对照管和测定管加入上述步骤C中的酶促反应液，混匀后室温静置 反应lOmin，然后使用分光光度计在660nm处，lcm光径条件下检测各管的吸光度值E、V 型-H+-ATP 酶（VHA)活性定量计算：组织 Vacuolar-Type_H+-ATPase 活力（U/mg prot)= (测定0D值-对照0D值）八标准00值-空白00值）*标准品浓度（0.02^111〇1/1^)*2*7/ 待测样本蛋白浓度（mgprot/mL)。
5. 根据权利要求4所述的花鳗麵V型-H +-ATP酶（VHA)活性的检测方法，其特征在于： 步骤A所述缓冲液配方为：150mmol/，L鹿糖，10mmol/，L EDTA Na2,50mmol/，L咪挫， 0. 1 %脱氧胆酸钠。
6. 根据权利要求4所述的花鳗麵V型-H +-ATP酶（VHA)活性的检测方法，其特征在于： 步骤C所述对照管和测定管的反应体系为：分别向两个体系中加入10 y L样本，100 y L ATP Na2 (3. 6mM)，70 y L NaCl (125mM)，70 y L KC1 (75mM)，50 y L MgCl2 (7. 5mM)，然后向对照管加 入50yL巴弗洛霉素 Al(40ymol/ ? L)，向测定管中加入50yL双蒸水。
7. 根据权利要求1所述的花鳗麵V型-H+-ATP酶（VHA)活性的检测方法，其特征在于： 步骤C所述终止酶促反应条件为：冰浴条件下反应10min。
8. 根据权利要求1所述的花鳗麵V型-H+-ATP酶（VHA)活性的检测方法，其特征在 于：步骤D所述定磷显色剂体系为：向空白管、标准管、对照管、测定管分别加入lmL钼酸 铵硫酸溶液、〇. 35mL二氯化锡溶液，然后向空白管加入0. 3mL双蒸水、向标准管加入0. 3mL 0. 02 y mol/mL磷标准液（mL)、向对照管和测定管加入0. 3mL上述步骤C中的酶促反应液。
【文档编号】G01N21/78GK104458724SQ201410724848
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月3日 优先权日:2014年12月3日
【发明者】尹绍武, 李丽, 张国松, 王丽, 王小鲁 申请人:南京师范大学