一种离子稳定剂和悬浮稳定剂配合使用的d二聚体乳胶增强免疫比浊检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及体外诊断试剂盒，特别是涉及一种离子稳定剂和悬浮稳定剂配合使用的D二聚体乳胶增强免疫比浊检测试剂盒。本发明提供一种离子稳定剂和悬浮稳定剂配合使用的D二聚体乳胶增强免疫比浊检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2两种组分，所述试剂R1主要由缓冲液1、稳定剂1、防腐剂1、促凝剂和保护剂1组成；所述试剂R2主要由缓冲液2、两种交联不同D二聚体单克隆抗体的聚苯乙烯胶乳微球、稳定剂2、保护剂2、防腐剂2组成，所述试剂R2中的稳定剂2采用离子稳定剂和悬浮稳定剂配合使用。与现有技术相比，本发明采用胶乳增强免疫比浊法，可以在400～800nm的波长下进行检测，检测更为方便，容易在临床中应用。
【专利说明】一种离子稳定剂和悬淳稳定剂配合使用的D二聚体乳胶增 强免疫比浊检测试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及体外诊断试剂盒，特别是涉及一种离子稳定剂和悬浮稳定剂配合使用 的D二聚体乳胶增强免疫比浊检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 纤维蛋白溶解系统是人体最重要的抗凝系统，由4种主要部分组成：纤溶酶原、纤 溶酶原激活剂、纤溶酶、纤溶酶抑制物。当纤维蛋白凝结块形成时，在纤溶酶原激活剂的存 在下，纤溶酶原激活转化为纤溶酶，纤维蛋白溶解过程开始，纤溶酶降解纤维蛋白凝结块形 成各种可溶片段，形成纤维蛋白产物（FDP)，FDP由X-寡聚体、D-二聚体、中间片段及片段 E (Fragment E)组成。其中，X-寡聚体和D-聚体均含D-二聚体单位。
[0003] 人体纤溶系统，它对保持血管壁的正常通透性，维持血液的流动状态和组织修复 起着重要作用。D-二聚体血浆中水平增高说明存在继发性纤溶过程，而先产生凝血酶，后又 有纤溶系活化；并且也反映在血栓形成的局部纤溶酶活性或浓度超过血浆2%。一抗纤溶酶 活性或浓度。溶栓治疗是指用药物来活化纤维蛋白溶解系统。一般为投入一种纤溶酶原活 化物如尿液酶、链激酶或组织型纤溶酶原活化物（tpA)，使大量纤溶酶生成，从而加速已形 成血栓的溶解。FDP或D-二聚体生成，表明达到溶栓效果。
[0004] 纤溶蛋白降解产物中，唯D-二聚体交联碎片可反映血栓形成后的溶栓活性。因 此，理论上，D-二聚体的定量检测可定量反映药物的溶栓效果、及可用于诊断、筛选新形成 的血栓。因此，纤维D-二聚体是深静脉血栓（DVT)，肺栓塞（PE)，弥漫性血管内凝血（DIC) 的关键指标。临床上对D-二聚体含量的检测可用于以下疾病的诊断：脑血管疾病、肝脏疾 病、外科手术患者、溶栓治疗的监测等。
[0005] D-二聚体的测定方法很多，有ELISA、TRIFMA、胶体金，胶乳增强免疫比浊法等。目 前在临床上应用较为广泛的是胶体金法，ELISA操作要求严格，比较费时，胶体金作为定性 或半定量方法，对于定量，稍有不足。而胶乳增强免疫比浊法有快速，定量和成本低的优势， 越来越受到临床医生的关注。
【发明内容】
[0006] 鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种稳定性好，检测灵敏 度高，线性范围广的的D二聚体检测试剂盒，以及D二聚体检测试剂盒的制备方法，用于解 决现有技术中的问题。
[0007] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种离子稳定剂和悬浮稳 定剂配合使用的D二聚体乳胶增强免疫比浊检测试剂盒，包括试剂Rl和试剂R2两种组分， 所述试剂Rl主要由缓冲液1、稳定剂1、防腐剂1、促凝剂和保护剂1组成；所述试剂R2主 要由缓冲液2、交联D二聚体单克隆抗体的聚苯乙烯胶乳微球、稳定剂2、保护剂2、防腐剂2 组成，其中聚苯乙烯胶乳微球与D二聚体抗体之间以共价交联或物理吸附方式连接。
[0008] 优选的，本发明中聚苯乙烯胶乳微球交联两种不同的D二聚体单克隆抗体。
[0009] 本技术方案中的D二聚体胶乳增强免疫比浊试剂盒，将D二聚体抗体交联在聚苯 乙烯胶乳微球表面，当血液中的D二聚体与D二聚体抗体反应时，带动聚苯乙烯胶乳微球聚 集产生一定浊度，而浊度与血液中的D二聚体含量在一定范围成正比，可以用全自动生化 仪在400-800nm波长下检测血液中D二聚体的含量。
[0010] 优选的，所述试剂Rl中的缓冲液1选自Hepes缓冲液、TriS-HCl缓冲液、MOPS缓冲 液、PBS缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼砂缓冲液、柠檬酸缓冲液中的一种或几种，其pH为6. 0? 9. 0,浓度为25?500mmol/L ;所述试剂R2中的缓冲液2选自PBS缓冲液、硼砂缓冲液、甘氨 酸缓冲液、H印es缓冲液、GOODS缓冲液、MOPS缓冲液中的一种或几种，其pH为7. 0?9. 0， 浓度为25?500mmol/L。
[0011] 本发明试剂Rl中的缓冲液1可使用上述本领域各种常用的缓冲液，但为了使得试 剂盒具有更佳的灵敏度和显色效果，本发明中所述试剂Rl中缓冲液1优选为包括下列组 分：水苏糖、明矾、果糖二磷酸钠、六偏磷酸钠和甘氨酸的水溶液，且水苏糖、明矾、果糖二磷 酸钠、六偏磷酸钠、甘氨酸的总浓度为3. 5 - 7. 5g/L，缓冲液的pH值为7. 2 - 7. 6。
[0012] 优选的，各组分在缓冲液1中的浓度为：
[0013]
【权利要求】
1. 一种离子稳定剂和悬浮稳定剂配合使用的D二聚体乳胶增强免疫比浊检测试剂盒， 包括试剂R1和试剂R2两种组分，所述试剂R1主要由缓冲液1、稳定剂1、防腐剂1、促凝剂 和保护剂1组成；所述试剂R2主要由缓冲液2、交联D二聚体单克隆抗体的聚苯乙烯胶乳 微球、稳定剂2、保护剂2、防腐剂2组成，其中聚苯乙烯胶乳微球与D二聚体抗体之间以共 价交联或物理吸附方式连接，所述试剂R2中的稳定剂2采用离子稳定剂和悬浮稳定剂配合 使用；其中离子稳定剂为NaCl、KC1、Na2C03、Na2S04或者K2S04,悬浮稳定剂为PEG8000、蔗 糖、甘油或者葡萄糖。
2. 如权利要求1所述的一种离子稳定剂和悬浮稳定剂配合使用的D二聚体乳胶增强 免疫比浊检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中的缓冲液1选自Hepes缓冲液、Tris-HCl 缓冲液、MOPS缓冲液、PBS缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼砂缓冲液、柠檬酸缓冲液中的一种或几 种，其pH为6. 0?9. 0,浓度为25?500mmol/L。
3. 如权利要求1所述的一种离子稳定剂和悬浮稳定剂配合使用的D二聚体乳胶增强免 疫比浊检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中的缓冲液2选自PBS缓冲液、硼砂缓冲液、 甘氨酸缓冲液、Hepes缓冲液、GOODS缓冲液、MOPS缓冲液中的一种或几种，其pH为7. 0? 9. 0,浓度为 25 ?500mmol/L。
4. 如权利要求1所述的一种离子稳定剂和悬浮稳定剂配合使用的D二聚体乳胶增强免 疫比浊检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中的稳定剂1选自KCl、NaCl、CaCl中的一种 或者几种，其质量浓度为0.5 %?10%。
5. 如权利要求1所述的一种离子稳定剂和悬浮稳定剂配合使用的D二聚体乳胶增 强免疫比浊检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中的防腐剂1为叠氮钠、硫柳汞或者 ProClin300 ;所述试剂R2中的防腐剂2为叠氮钠、硫柳汞或ProClin300。
6. 如权利要求1所述的一种离子稳定剂和悬浮稳定剂配合使用的D二聚体乳胶增强免 疫比浊检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中的促凝剂为PEG8000或者葡聚糖。
7. 如权利要求1所述的一种离子稳定剂和悬浮稳定剂配合使用的D二聚体乳胶增强 免疫比浊检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中的聚苯乙烯乳胶微球的表面官能团为氨 基、羧基、酰肼、醒基或环氧基，聚苯乙烯乳胶微球的粒径在100?500nm。
8. 如权利要求1所述的一种离子稳定剂和悬浮稳定剂配合使用的D二聚体乳胶增强免 疫比浊检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中的D二聚体抗体为兔抗人D二聚体单克隆 抗体、鼠抗人D二聚体单克隆抗体一种或者几种。
9. 如权利要求1所述的一种离子稳定剂和悬浮稳定剂配合使用的D二聚体乳胶增强 免疫比浊检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中的保护剂1为EDTA，所述EDTA的浓度为 10?100mm〇l/L，所述试剂R2中的保护剂2为牛血清白蛋白。
10. 如权利要求1-9任一权利要求所述的利用表面官能团的D二聚体乳胶增强免疫比 浊检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤： (1) 试剂R1的制备：在缓冲液1中加入稳定剂1、促凝剂、防腐剂1、保护剂1，搅拌混合 均匀，即得试剂R1 ; (2) 试剂R2的制备：用标记缓冲液将聚苯乙烯胶乳微球稀释到质量浓度为1%，再加入 质量浓度为〇. 01 % _〇. 1 %的EDC，在室温下搅拌反应60min，反应结束后15000rpm离心洗 涤以除去未反应的EDC，然后加入D二聚体单克隆抗体，37°C下搅拌反应4h，再加入终止液 4h终止反应，将得到的反应液15000rpm离心、洗涤，最后用包括、稳定剂2、保护剂2、防腐剂 2的缓冲液2将胶乳重悬。
【文档编号】G01N33/577GK104360072SQ201410736445
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年12月5日 优先权日:2014年12月5日
【发明者】高昂 申请人:重庆中元生物技术有限公司