L-精氨酸-α-酮戊二酸的高效液相色谱检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种L-精氨酸-α-酮戊二酸的高效液相色谱检测方法，涉及柱色谱法【技术领域】。其色谱条件为：色谱柱：C18色谱柱；流动相：0.02mol/L～0.08mol/L磷酸盐缓冲液，pH3.0-4.0；流动相流速：0.5-1.3ml/min；检测波长：200-210nm；色谱柱柱温：15℃～30℃，进行高效液相色谱分析，测定L-精氨酸-α-酮戊二酸或其制剂中L-精氨酸和α-酮戊二酸的含量。本发明可以通过一次高效液相色谱检测，同时准确测定出L-精氨酸-α-酮戊二酸或其制剂中L-精氨酸和α-酮戊二酸含量，两种成分能达到良好的分离，而且C18色谱柱平衡时间短，约需30-40分钟便可，提高了工作效率。
【专利说明】L-精氨酸-α-酮戊二酸的高效液相色谱检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及柱色谱法【技术领域】。
【背景技术】
[0002] L-精氨酸-α-酮戊二酸是目前国际市场上销售量日益增大的一种氨基酸盐类保 健品，主要用于提高人体蛋白质和增强人的体格等。有I: 1和2 : 1(精氨酸和酮戊二酸 的摩尔比）两种规格，L-精氨酸-α-酮戊二酸（2 : 1)及其制剂是法国瑞法兰药厂研制的 护肝药物，针对肝脏功能失调能直接且快速提供营养，给肝细胞提供能量，迅速维护肝脏正 常功能及健康。
[0003] 现有技术中景宏武等公开了采用分光光度法测定α-酮戊二酸（α-酮戊二酸和 丙酮酸的分光光度法同时测定，同济大学学报，1986,14 (4) :531-536)，但分光光度法精度 差，准确性不高，而且仅能测定α-酮戊二酸的含量。
[0004] 毛影等公开了采用高效液相色谱法测定酮戊二酸的含量（HPLC法测定酮戊二酸 的含量，中国药事，2008,22 (10):598-599)，其采用六8116扯003(：18柱，以0.5%(順 4) ，04-呀04缓冲液为流动相，流速为I.Oml/min，紫外检测波长为233nm，但该方法也仅能用 于测定酮戊二酸的含量，无法对L-精氨酸-α-酮戊二酸进行含量检测。
[0005] 2010版中国药典注射用头孢他啶品种项下含量测定中精氨酸含量测定，用二羟基 丙基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-pH2.O磷酸盐缓冲液(称取磷酸二氢铵I. 15g，加水 800ml使溶解后，用磷酸调节pH值至2.0,再用水稀释至1000ml，混匀）（750 : 250)为流 动相，检测波长为206nm，但该方法仅能测定L-精氨酸的含量。
[0006] 申请号201010192571. 1的专利一种酮戊二酸精氨酸盐的HPLC检测方法(北京嘉 事联博医药科技有限公司）中色谱条件为：流动相乙腈-磷酸盐缓冲液=60 : 40,其中的磷 酸盐缓冲液为〇. 〇2mol/L磷酸二氢钠溶液，并用0. 02mol/L的磷酸氢二钠溶液调节pH值至 5. 2 ;流速I.Oml/L，检测波长205nm，色谱柱为AgilentΝΗ2,5μηι，4· 6X250mm的氨基柱，但 氨基柱平衡时间长，大约需1-2小时，甚至更长，基线不易稳定。而且氨基柱的键合官能团 氨丙基要比C18X8柱的键合官能团C18X8容易水解，所以使用寿命与C18X8柱相比稍逊。当 使用氨基柱进行酸性物质的检测时，酸性物质的存在意味着质子的存在，会使略带负电荷 的氨基官能团质子化，从而导致使用一段时间后对于某些类的分析物保留性质有所改变或 表现在柱效下降，影响含量测定准确性。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的技术问题是提供一种L-精氨酸-α -酮戊二酸的高效液相色谱检 测方法，采用C18色谱柱，进行高效液相色谱分析，可以通过一次高效液相色谱检测，同时准 确测定出L-精氨酸-α-酮戊二酸或其制剂中L-精氨酸和α-酮戊二酸的含量，两种成分 能达到良好的分离，可方便地用于L-精氨酸-α-酮戊二酸含量的检测，确保其质量可控， 而且C18色谱柱平衡时间短，约需30-40分钟便可，提高了工作效率。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：一种L-精氨酸-α-酮戊二酸 的高效液相色谱检测方法，其色谱条件为： 色谱柱：C18色谱柱； 流动相：〇. 02mol/L?0. 08mol/L磷酸盐缓冲液，pH3. 0-4. 0 ; 流动相流速：〇. 5-1. 3ml/min; 检测波长：200-210nm; 色谱柱柱温：15°C?30°C; 进行高效液相色谱分析，测定L-精氨酸-α-酮戊二酸或其制剂中L-精氨酸和α-酮 戊二酸的含量。
[0009] 优选的，L-精氨酸-α-酮戊二酸的高效液相色谱检测方法，包括以下步骤： (1) 配制流动相，调节PH值，过滤、脱气； (2) 调节高效液相色谱仪条件，开机平衡色谱柱； (3) 对照品和供试品溶液的配置：称取L-精氨酸和α-酮戊二酸对照品及L-精氨 酸-α-酮戊二酸供试品，分别用流动相溶解定容，即得； (4) 将对照品溶液、供试品溶液过滤后注入高效液相色谱仪，记录色谱图及峰面积，采 用外标法计算含量。
[0010] 采用本发明方法可以使L-精氨酸、α-酮戊二酸两种成分良好的分离，适合各种 规格L-精氨酸-α-酮戊二酸产品（L-精氨酸与α-酮戊二酸的摩尔比可为任意值）含量 的测定。
[0011] 优选的，L-精氨酸-α-酮戊二酸中L-精氨酸与α-酮戊二酸的摩尔比为I: 1 或2 : 1。
[0012] 优选的，流动相为0. 05mol/L磷酸盐缓冲液。
[0013] 进一步优选的，磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钠或磷酸二氢钾缓冲液。
[0014] 更进一步优选的，磷酸盐缓冲液的pH值为3. 4。
[0015] 优选的，流动相流速为I.Oml/min;检测波长为205nm。
[0016] 优选的，L-精氨酸与α-酮戊二酸的摩尔比为I: 1的L-精氨酸-α-酮戊二酸 供试品溶液的浓度为〇. 3-1.Omg/mL;L-精氨酸与α-酮戊二酸的摩尔比为2 : 1的L-精 氨酸-α-酮戊二酸供试品溶液的浓度为〇. 5-1. 5mg/mL。
[0017] 进一步优选的，L-精氨酸与α-酮戊二酸的摩尔比为I:1的L-精氨酸-α-酮戊 二酸供试品溶液的浓度为〇. 64mg/mL;L-精氨酸与α-酮戊二酸的摩尔比为2 : 1的L-精 氨酸-α-酮戊二酸供试品溶液的浓度为0. 96mg/mL。
[0018] 进一步优选的，进样体积为20μ1。
[0019] 本发明流动相的选择：L_精氨酸-α-酮戊二酸易溶于水，在有机溶剂中不溶，采 用纯水相流动相，样品溶解更充分，而且ODS(：18色谱柱是亲水性色谱柱，适用于纯水相流动 相，两者结合使检测结果更准确。流动相含有机相有可能造成样品析出，严重的会堵塞色谱 柱，造成损失。
[0020] 采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本方法可以通过一次高效液相色谱检 测，同时准确测定出L-精氨酸-α-酮戊二酸或其制剂中L-精氨酸和α-酮戊二酸的含量， 两种成分能达到良好的分离，可方便地用于L-精氨酸-α-酮戊二酸含量的检测，确保其质 量可控。并且简便快捷，节省了人工、时间和溶剂等，成本低。经验证，该方法有良好的精密 度和准确度。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明； 图1是本发明实施例1中L-精氨酸-α-酮戊二酸供试品的色谱图； 图2是本发明实施例2中L-精氨酸-α-酮戊二酸供试品的色谱图； 图3是L-精氨酸线性关系的标准曲线图； 图4是α-酮戊二酸线性关系的标准曲线图。
【具体实施方式】
[0022] 本发明的实施例仅用来说明实现本发明的技术方案，这些实施方式并不对本发明 构成进一步限定。以下实施例中，采用的高效液相色谱仪为日本岛津：LC-15C，SPD-15C;色 谱柱为LunaC18 5μπι4.6X250mm;进样体积为20μ1(定量环)。也可以采用其他厂家 和型号的高效液相色谱仪、其他粒径和长度的C18色谱柱以及其他进样体积，都能达到本发 明的目的。
[0023] 实施例1 色谱条件 流动相：〇· 05mol/L磷酸二氢钠缓冲液(用0· 05mol/L磷酸调节pH值至3. 4) 流动相流速：1.Oml/min检测波长：205nm 色谱柱柱温：25°C 实验步骤： (1) 配制流动相，调节PH值，过滤、脱气； (2) 调节高效液相色谱仪条件，开机平衡色谱柱； (3)对照品和供试品溶液的配置： 对照品溶液：分别称取L-精氨酸对照品34. Omg和α-酮戊二酸对照品29. Omg于IOOml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，得到对照品溶液。
[0024] 供试品溶液：称取L-精氨酸-α-酮戊二酸（L-精氨酸与α-酮戊二酸的摩尔比 为I:I)64mg置于IOOml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0025] (4)将对照品溶液、供试品溶液过滤后注入高效液相色谱仪，记录色谱图及峰面 积，采用外标法计算含量。
[0026] 供试品溶液色谱图见图1所示：2. 829min为L-精氨酸的峰，3. 487min为α-酮戊 二酸的峰，其余为杂质峰，两主峰出峰时间适宜、理论塔板数大于5000,且与杂质分离度良 好。
[0027] 具体数值见下表所示：
【权利要求】
1. 一种L-精氨酸-a -酮戊二酸的高效液相色谱检测方法，其特征在于，其色谱条件 为： 色谱柱：C18色谱柱； 流动相：〇. 02mol/L?0. 08mol/L磷酸盐缓冲液，pH3. 0-4. 0 ; 流动相流速：〇. 5-1. 3ml/min ; 检测波长：200-210nm ; 色谱柱柱温：15°C?30°C ; 进行高效液相色谱分析，测定L-精氨酸-a -酮戊二酸或其制剂中L-精氨酸和a -酮 戊二酸的含量。
2. 根据权利要求1所述的L-精氨酸-a -酮戊二酸的高效液相色谱检测方法，其特征 在于包括以下步骤： (1) 配制流动相，调节pH值，过滤、脱气； (2) 调节高效液相色谱仪条件，开机平衡色谱柱； (3) 对照品和供试品溶液的配置：称取L-精氨酸和a -酮戊二酸对照品及L-精氨 酸-a -酮戊二酸供试品，分别用流动相溶解定容，即得； (4) 将对照品溶液、供试品溶液过滤后注入高效液相色谱仪，记录色谱图及峰面积，采 用外标法计算含量。
3. 根据权利要求1或2所述的L-精氨酸-a -酮戊二酸的高效液相色谱检测方法，其 特征在于所述L-精氨酸-a-酮戊二酸中L-精氨酸与a-酮戊二酸的摩尔比为1 : 1或 2:1。
4. 根据权利要求1所述的L-精氨酸-a -酮戊二酸的高效液相色谱检测方法，其特征 在于所述流动相为〇. 〇5mol/L磷酸盐缓冲液。
5. 根据权利要求1或4所述的L-精氨酸-a -酮戊二酸的高效液相色谱检测方法，其 特征在于所述磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钠或磷酸二氢钾缓冲液。
6. 根据权利要求5所述的L-精氨酸-a -酮戊二酸的高效液相色谱检测方法，其特征 在于所述磷酸盐缓冲液的pH值为3. 4。
7. 根据权利要求1所述的L-精氨酸-a -酮戊二酸的高效液相色谱检测方法，其特征 在于所述流动相流速为1. 〇ml/min ;检测波长为205nm。
8. 根据权利要求2所述的L-精氨酸-a -酮戊二酸的高效液相色谱检测方法，其特征 在于，L-精氨酸与a -酮戊二酸的摩尔比为1 : 1的L-精氨酸-a -酮戊二酸供试品溶液 的浓度为〇. 3-1. Omg/mL ;L_精氨酸与a -酮戊二酸的摩尔比为2 : 1的L-精氨酸-a -酮 戊二酸供试品溶液的浓度为〇. 5-1. 5mg/mL。
9. 根据权利要求8所述的L-精氨酸-a -酮戊二酸的高效液相色谱检测方法，其特征 在于，L-精氨酸与a -酮戊二酸的摩尔比为1 : 1的L-精氨酸-a -酮戊二酸供试品溶液 的浓度为〇. 64mg/mL;L-精氨酸与a-酮戊二酸的摩尔比为2 : 1的L-精氨酸-a-酮戊 二酸供试品溶液的浓度为〇. 96mg/mL。
10. 根据权利要求8所述的L-精氨酸-a -酮戊二酸的高效液相色谱检测方法，其特征 在于，进样体积为20 y 1。
【文档编号】G01N30/02GK104483406SQ201410794723
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月19日 优先权日:2014年12月19日
【发明者】李斌水, 何瑞红, 郭志建, 张柳 申请人:精晶药业股份有限公司