中药八味补白片的检测方法
【专利摘要】本发明提供一种治疗白癜风的中药八味补白片的检测方法，包括以下步骤：(一)中药八味补白片中的补骨脂、黄芪和丹参的鉴别方法：(1)中药八味补白片中的补骨脂显微鉴别；(2)中药八味补白片中黄芪的薄层鉴别；(3)中药八味补白片中丹参的薄层鉴别；(二)中药八味补白片中补骨脂的补骨脂素和异补骨脂素的高效液相色谱捡测，含量以补骨脂素和异补骨脂素总量计算，不低于0.30mg。本发明方法稳定可靠，专一性和科学性强，可以有效监测中药八味补白片的质量，有较大的应用价值。
【专利说明】中药八味补白片的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中药复方制剂，具体涉及治疗白癜风的中药八味补白片的检测方法。
【背景技术】
[0002] 白癜风是一种后天性色素减退性皮肤病，最新研究证实，由于白癜风患者紫外线 防御能力弱，皮肤癌的发病率比正常人要高很多，同时还可诱发多种疾病，中医认为，白癜 风主要因先天禀赋不足，惊恐伤肾，郁怒伤肝，日久耗伤阴血，使肝肾精血亏虚，复外感风 邪，阻滞经脉，使局部气血瘀滞，致腠理气血失和，肌肤不得濡养所致。现代医学有关白癜风 病因及发病机制学说众多，有自身免疫学说、黑素细胞自身破坏学说、神经化学因子学说、 黑素细胞生长因子缺乏学说、遗传因素等，其中，黑素细胞生成缺乏和自身破坏学说占主导 地位。
[0003]中药八味补白片方由黄芪、蒺藜、川芎、当归、丹参、补骨脂、红花、香附8味中药材 组成。其中当归、黄芪柔肝养血，健脾益气，补后天之本以充气血生化之源；补骨脂益肾填 精，"乙癸同源，肝肾同治"；川；、红花、丹参行气活血；白蒺藜、香附疏风祛邪以通络，共奏 调和气血，活血化瘀之效。诸药合用可以调和气血，活血化瘀，补益肝肾，祛风散邪。
[0004] 由于复方中药八味补白片有八味中药，成分复杂多样，在中药产品的检测中常常 都会带来相互干扰，因此，对判断该药中药物在制备成产品后，判断产品的工艺是否合理， 产品中有效成分是否富集，最终产品的质量是否稳定等，建立一个合理的、体现产品质量和 检测水平的质量标准是十分关键的技术。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题在于研究设计中药八味补白片的检测方法，用现代的 色谱和显微等分析技术，选择合理的分离、提取的方法及手段，有效控制其活性成分作为指 标，新建立控制产品质量的标准。
[0006] 本发明采用薄层色谱对此中药制剂中的八味药材黄芪、丹参、当归、盐补骨脂、炒 蒺藜、红花等进行了全面的薄层色谱（TLC)定性研究，对君药补骨脂进行了含量测定研究， 其中黄芪、丹参、盐补骨脂通过本复方产品的检测方法优选，获得了较满意的薄层色谱结 果和补骨脂的定量测定方法。现代医学认为，丹参、当归中含有有机酸类及其他多种微量 元素，因此具有活血补血的作用；黄芪中含有的主要化学成分为黄酮类、皂苷类和多糖等， 具有增强机体免疫功能和应激力的作用。盐补骨脂含有呋喃香豆素类物质，有提高皮肤 对紫外线敏感作用，刺激黑色素细胞的形成，对酪氨酸酶的活性也有较强的激活作用。业 已证实，酪氨酸酶的活性直接与黑素含量有关，上调酪氨酸酶的活性，加速黑素生成的药 物可提高白癜风的治疗效果。呋喃香豆素（?111'〇〇〇111]1&1'；[116)为香豆素类的6,7或7,8位 与呋喃基并合而成的化合物的总称。补骨脂素（Psoralene)分子式为CnH603、异补骨脂素 (Angelicin)，分子式为CnH603，为呋喃香豆素主要代表物质。所以本发明选定补骨脂素和 异补骨脂素二种活性成分为代表，作为指标性成分，控制产品的质量。本发明提供中药八味 补白片中补骨脂、黄芪、丹参的鉴别方法及补骨脂中补骨脂素和异补骨脂素含量测定的检 测方法。
[0007] 本发明提供了一种中药八味补白片的检测方法，该方法包括以下步骤：
[0008]( -）中药八味补白片中的补骨脂、黄芪和丹参的鉴别方法：
[0009] (1)中药八味补白片中的补骨脂显微鉴别，呈显微特征图，见图1
[0010] (2)中药八味补白片中黄芪的薄层鉴别，呈特征色谱图，见图2
[0011] ⑶中药八味补白片中丹参的薄层鉴别，呈特征色谱图，见图3
[0012] (二）中药八味补白片中补骨脂的补骨脂素和异补骨脂素的高效液相色谱含量检 测：每片含量以补骨脂素（CnH603)和异补骨脂素（CnH603)总量计算，不低于0. 30mg，见图5
[0013] 具体地，本发明中药八味补白片中的补骨脂、黄芪和丹参的鉴别方法包括以下步 骤：
[0014] (1)本发明采用薄层层析法鉴别八味补白片中的补骨脂
[0015] 取八味补白片适量，研细，称取2g，加乙酸乙酯或甲醇，超声或热回流，滤过，滤液 蒸干，残渣加乙酸乙酯或甲醇使溶解，作为供试品溶液。另取补骨脂对照药材，同法制成对 照药材溶液。照薄层色谱法（中国药典2010年版一部VIB)试验，吸取上述对照药材溶液、 供试品溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯（4:1)或石油醚-乙酸乙 酯（4:1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm)下或喷以10%的氢氧化钠甲醇溶 液置紫外光灯（365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材溶液相应位置上，显相同颜色 斑点。
[0016] (2)采用薄层层析法鉴别八味补白片中的黄芪
[0017] 因黄芪为本方中的主药之一，其的主要活性成分为黄芪甲苷，本发明选择黄芪甲 苷作为对照品，鉴别本产品的质量。
[0018] 取八味补白片适量，研细，称取2g，加水或乙醇适量，置水浴上加热回流或超声，放 冷，取上清液，用乙醚振摇，洗涤，弃去乙醚液，再用水饱和的正丁醇振摇提取数次，合并正 丁醇提取液，用等量的氨试液洗涤，再用等量的正丁醇饱和的水洗涤数次，正丁醇液蒸干， 残渣加甲醇lml使溶解，离心，取上清液作为供试品溶液。另取黄芪对照药材适量，同法制 成对照药材溶液。取黄芪甲苷对照品，加甲醇适量制成，作为对照品溶液。照薄层色谱法 (中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述三种溶液适量，分别点于同一硅胶G薄 层板上，以乙酸乙酯-乙醇-水（8:2:1)或（三氯甲烷-甲醇-水（12:5:3)为展开剂，展 开，取出，晾干，直接加热或喷以10%的硫酸乙醇溶液，105°C加热至斑点清晰。供试品色谱 中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点及荧光主斑点。
[0019] (3)采用薄层层析法鉴别八味补白片中的丹参
[0020] 取八味补白片适量，研细，称取2g，加水或乙醇适量，置水浴上加热回流或超声溶 解，加盐酸溶液适量，混匀，离心，取上清液，加等量乙醚提取2次，合并提取液，离心分层， 吸取乙醚提取液，挥干，用无水乙醇适量使溶解，作为供试品溶液。另取丹参对照药材适量， 同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（中国药典2010年版一部VIB)试验，吸取上述两 种溶液适量，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-三氯甲烷-苯-甲酸（6 :5 :3 :1) 或三氯甲烷-丙酮-甲酸（8:2:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%的三氯化铁乙醇溶 液，105°C加热至斑点清晰。供试品色谱中，在与对照药材溶液相应位置上，显相同的颜色斑 点。
[0021] (二）采用高效液相色谱法定量检测八味补白片中补骨脂的补骨脂素和异补骨脂 素含量。
[0022] 由于补骨脂中的主要活性成分为补骨脂素（CnH603)和异补骨脂素（CnH603)，因 此，选择补骨脂素和异补骨脂素作为定量检测补骨脂的标准品。
[0023]补骨脂的补骨脂素和异补骨脂素含量测定：
[0024] 色谱条件与系统适用性：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水（50:50) 或（55 :45)为流动相；检测波长为246nm。理论板数按补骨脂峰计算应不低于3000。
[0025] 对照品溶液的制备：取在减压干燥（真空度_0.IMpa，温度60°C) 12-24小时的补 骨脂素和异补骨脂素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml各含15-20yg的溶液，即 得。
[0026] 供试品溶液的制备：取八味补白片20片，碾细，精密称定2. 0g，置索氏提取器中或 圆底烧瓶中，加甲醇或乙醇80-120ml，加热回流2-5小时；或浸泡过夜，再加热回流2-5小 时，放冷，转移至l〇〇ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得供试品。
[0027] 测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10-20yl，注入液相色谱仪， 测定。
[0028] 每片八味补白片含补骨脂，以补骨脂素（CnH603)和异补骨脂素（CnH603)总量计 算，不低于〇? 30mg。
[0029] 其优选的供试品溶液的制备方法是：取八味补白片20片，碾细，精密称定2. 0g，置 索氏提取器中，加甲醇80ml，加热回流4小时；放冷，转移至100ml容量瓶中，加甲醇定容至 刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得供试品。
[0030] 在中药进入标准化时代，产品的质量是产品的生命，拥有产品的标准则是拥有关 键技术。本发明提供了八味补白片产品的质量标准的检测方法，经过科学的方法学研究，优 选出的方法稳定可靠，专一性和科学性强，可以有效检测复方中药八味补白片的相关成分， 为使用者提供有保证质量的产品，有较大的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0031] 图1、实施例1八味补白片中补骨脂的薄层色谱图，图中：从左至右，斑点顺序， 1-阴性空白（缺盐补骨脂）2-盐补骨脂阳性单味药材3-4-5-八味补白片样品；
[0032] 图2、实施例1八味补白片中黄芪的薄层色谱图，图中：从左至右，斑点顺序，1-阴 性空白（缺黄芪）2_黄芪甲苷3-黄芪对照药材4-5-6-八味补白片样品；左图为日光下视 检，右图为紫外灯365nm下检视；
[0033] 图3、实施例1八味补白片中丹参的薄层色谱图，图中：从左至右，斑点顺序，1-阴 性空白（缺丹参）2_丹参对照药材3-4-5-八味补白片样品；
[0034] 图4、实施例4补骨脂素（前）、异补骨脂素（后）对照品的高效液相色谱图；
[0035] 图5、实施例4八味补白片样品中补骨脂-补骨脂素、异补骨脂素的高效液相色谱 图；
[0036] 图6、实施例4空白样品（缺补骨脂）中的高效液相色谱图。
【具体实施方式】
[0037] 以下实施例使用的八味补白片产品由上海百岁行药业有限公司生产。
[0038] 实施例1、八味补白片检测试验
[0039] (1)薄层层析色谱法中补骨脂鉴别：取八味补白片10片，研细，称取2g，加乙酸乙 酯20ml，超声处理15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯lml使溶解，作为供试品溶液。 另取补骨脂对照药材（中国药品生物检定所）〇.5g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱 法（中国药典2010年版一部VIB)试验，吸取上述对照药材溶液5yl，供试品10yl，分别 点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-醋酸乙酯（4 :1V/V)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以 10%的氢氧化钠甲醇溶液置紫外光灯（365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材溶液 相应位置上，显相同颜色斑点。八味补白片中的补骨脂显微鉴别，呈显微特征图，见图1。
[0040] (2)取本品10片，研细，称取2g，加水50ml，置水浴上加热回流30分钟，放冷，离 心，取上清液，用乙醚振摇提取2次，每次50ml，弃去乙醚液，再用水饱和的正丁醇振摇提取 2次，每次50ml，合并正丁醇提取液，用等量的氨试液洗涤，再用等量的正丁醇饱和的水洗 涤2次，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，离心，取上清液作为供试品溶液。另取黄芪 对照药材（中国药品生物检定所lg，同法制成对照药材溶液。取黄芪甲苷对照品（中国药 品生物检定所），加甲醇制成每lml含0. 5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中 国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述三种溶液各5yl，分别点于同一硅胶G薄 层板上，以乙酸乙酯-乙醇-水（8 :2 :1V/V)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%的硫酸 乙醇溶液，l〇5°C加热至斑点清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同 颜色的主斑点及荧光主斑点。八味补白片中黄芪的薄层鉴别，呈特征色谱图，见图2。
[0041] (3)取本品10片，研细，称取2g，用20ml水，超声处理30分钟溶解，加0?lmol/1 盐酸溶液l〇ml，混匀，离心10分钟，取上清液，加等量乙醚提取2次，合并提取液，离心分层， 吸取乙醚提取液，挥干，用无水乙醇lml使溶解，作为供试品溶液。另取丹参对照药材（中 国药品生物检定所）0.5g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（中国药典2010年版一 部VIB)试验，吸取上述两种溶液各5yl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-三 氯甲烷-苯-甲酸（6 :5 :3 :1V/V)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%的三氯化铁乙醇溶 液，105°C加热至斑点清晰。供试品色谱中，在与对照药材溶液相应位置上，显相同的颜色斑 点。八味补白片中丹参的薄层鉴别，呈特征色谱图，见图3。
[0042] (4)补骨脂的补骨脂素和异补骨脂素含量检测：
[0043] 色谱条件与系统适用性：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水（50:50) 为流动相；检测波长为246nm。理论板数按补骨脂峰计算应不低于3000。
[0044] 对照品溶液的制备：取在减压干燥12小时的补骨脂素（中国药品生物检定所）和 异补骨脂素（中国药品生物检定所）对照品，精密称定，加甲醇制成每lml各含15yg的溶 液，即得。
[0045] 供试品溶液的制备：取八味止白片20粒，碾细，称2. 5g，精密称定，置索氏提取器 中，加甲醇80ml，浸泡过夜，加热回流3小时，放冷，转移至100ml容量瓶中，用少量甲醇清洗 索氏提取器并入容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。
[0046] 测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10U1，注入液相色谱仪，测 定，即得。
[0047] 八味补白片中补骨脂的补骨脂素和异补骨脂素的高效液相色谱测定含量以补骨 脂素（CnH603)和异补骨脂素（CnH603)总量计算，不低于0. 30mg。
[0048] 八味止白片每片含补骨脂，以补骨脂素（CnH603)和异补骨脂素（CnH603)总量计算 取八味止白片样品产品（批号：xll0401、xll0402、xll0403)按照补骨脂质量标准草案对八 味止白片含量测定，结果见表8。
[0049] 表1.三批样品含量测定结果
[0050]
【权利要求】
1. 中药八味补白片的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤： (一） 中药八味补白片中的补骨脂、黄芪和丹参的鉴别方法： (1) 中药八味补白片中的补骨脂显微鉴别； (2) 中药八味补白片中黄芪的薄层鉴别； (3) 中药八味补白片中丹参的薄层鉴别； (二） 中药八味补白片中补骨脂的补骨脂素和异补骨脂素的高效液相色谱捡测，含量 以补骨脂素和异补骨脂素总量计算，不低于〇. 30mg。
2. 根据权利要求1所述的中药八味补白片的检测方法，其特征在于，步骤（一）（1)中 药八味补白片中的补骨脂显微鉴别方法为： 取八味补白片，研细，取2g加乙酸乙酯或甲醇，超声或热回流，滤过，滤液蒸干，残渣加 乙酸乙酯或甲醇使溶解，作为供试品溶液；另取补骨脂对照药材，同法制成对照药材溶液； 照薄层色谱法试验，吸取上述对照药材溶液，供试品，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正 己烷-乙酸乙酯4 :1V/V或石油醚-乙酸乙酯4:1V/V为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光 灯365nm下或喷以10%的氢氧化钠甲醇溶液置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与 对照药材溶液相应位置上，显相同颜色斑点。
3. 根据权利要求1所述的中药八味补白片的检测方法，其特征在于，步骤（一）（2)中 药八味补白片中黄芪的薄层鉴别方法为： 取八味补白片，研细，取2g加水或乙醇适量，置水浴上加热回流或超声，放冷，取上清 液，用乙醚振摇，洗涤，弃去乙醚液，再用水饱和的正丁醇振摇提数次，合并正丁醇提取液， 用等量的氨试液洗涤，再用等量的正丁醇饱和的水洗涤数次，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇 lml使溶解，离心，取上清液作为供试品溶液；另取黄芪对照药材适量，同法制成对照药材 溶液；取黄芪甲苷对照品，加甲醇适量制成，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上 述三种溶液适量，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-乙醇-水8 :2 :1V/V或三氯 甲烷-甲醇-水12:5: 3V/V为展开剂，展开，取出，晾干，直接加热或喷以10 %的硫酸乙醇溶 液，105°C加热至斑点清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的 主斑点及荧光主斑点。
4. 根据权利要求1所述的中药八味补白片的检测方法，其特征在于，步骤（一）（3)中 药八味补白片中丹参的薄层鉴别方法为： 取八味补白片研细，2g用水或乙醇醇适量，置水浴上加热回流或超声超声，溶解，力口 盐酸溶液适量，混匀，离心，取上清液，加等量乙醚提取2次，合并提取液，离心分层，吸取乙 醚提取液，挥干，用无水乙醇适量使溶解，作为供试品溶液；另取丹参对照药材适量，同法制 成对照药材溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液适量，分别点于同一硅胶G薄层板 上，以乙酸乙酯-三氯甲烷-苯-甲酸6 :5 :3 :1V/V或三氯甲烷-丙酮-甲酸8:2:1V/V为 展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%的三氯化铁乙醇溶液，l〇5°C加热至斑点清晰，供试品色 谱中，在与对照药材溶液相应位置上，显相同的颜色斑点。
5. 根据权利要求1所述的中药八味补白片的检测方法，其特征在于，步骤（二）中药八 味补白片中补骨脂的补骨脂素和异补骨脂素的高效液相色谱测定方法包括下列步骤： 色谱条件与系统适用性：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水50:50V/V或 55 :45V/V为流动相；检测波长为246nm，理论塔板数按补骨脂峰计算应不低于3000 ; 对照品溶液的制备：取在减压干燥（真空度-o. IMpa，温度60°C ) 12-24小时的补骨脂 素和异补骨脂素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml各含15-20 y g的溶液，即得； 供试品溶液的制备：取八味补白片20片，碾细，精密称定2. 0g，置索氏提取器中或圆 底烧瓶，加甲醇或乙醇80-120ml，加热回流2-5小时；或浸泡过夜，再加热回流2-4小时，放 冷，转移至l〇〇ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得供试品； 测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10-20 Ul，注入液相色谱仪，捡测测 定。
6.根据权利要求5所述的中药八味补白片的检测方法，其特征在于，步骤（二）中药八 味补白片中补骨脂的补骨脂素和异补骨脂素的高效液相色谱捡测，含量以补骨脂素和异补 骨脂素总量计算，不低于〇. 30mg。
【文档编号】G01N30/02GK104459011SQ201410821965
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月22日 优先权日:2014年12月22日
【发明者】朱建民, 杨莉娅, 毛士龙, 王拂尘, 张蓉蓉, 汪硕闻, 邵宝平, 李倩 申请人:上海市徐汇区中心医院