卡他莫拉菌量子点免疫层析检测卡的制作方法
【专利摘要】本实用新型提供了一种卡他莫拉菌量子点免疫层析检测卡，该检测卡包括底板、样品垫、吸水垫、结合垫和检测层；结合垫包被有量子点标记的抗卡他莫拉菌纳米探针；检测层是由带有一条检测线以及一条质控线的固相硝酸纤维素膜构成；检测线包被有鼠抗卡他莫拉菌UspAl蛋白多克隆抗体；质控线包被有抗兔IgG;检测层粘贴在底板上；结合垫和吸水垫分别设置在检测层两端部上方且与检测层部分重叠后分别与检测层和底板粘贴；样品垫设置在结合垫上方且与结合垫部分重合后分别与结合垫及底板粘贴。本实用新型具有操作简便、检测快速、可定量及高灵敏度等优点。
【专利说明】卡他莫拉菌量子点免疫层析检测卡
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及医学检测【技术领域】，具体为一种卡他莫拉菌量子点免疫层析检测卡。
【背景技术】
[0002]卡他莫拉菌(Moraxella catarrhal is, Mc)首次发现于1896年，当时称之为卡他微球菌(Micrococcus catarrhalis),尔后又称为卡他奈瑟菌(Neisseria catarrhal is)和卡他布兰汉菌(Branhamella catarrhalis)。卡他莫拉菌为革兰氏阴性球菌，通常呈肾形双球菌状，偶可呈四联状，无鞭毛，无芽胞，一般无荚膜。其营养要求不高，普通培养基上即可生长，需氧，最适生长温度为35°C。菌落直径I?3_，光滑型，灰白色，不透明，整个菌落易从培养基上刮下。较长时间培养后，菌落可呈粗糙颗粒状，黏附在培养基表面。产氧化酶和DNA酶。对糖类均不发酵。抵抗力较强，在痰中可存活27d，65°C时可存活30min。
[0003]过去一直认为Mc是对人体无致病性的上呼吸道正常寄居菌，但是，近20多年的研究发现，该菌不仅可以引起儿童和老年人的上呼吸道感染，而且还是引起成人下呼吸道感染的重要病原菌，是儿童上颌窦炎、中耳炎、肺炎以及成人的慢性下呼吸道感染的第3位最常见致病菌，仅次于肺炎支原体和肺炎链球菌。已有报道该菌可引起呼吸道医院感染爆发流行。因此，卡他莫拉菌及其所致感染日益受到人们关注，对该菌的生物学特性、流行病学、所致疾病、耐药性以及感染的防治有了更多的认识。
[0004]临床上由于Mc与其他呼吸道病原体引起的感染症状类似，因此常难以根据临床表现、X-射线检查等得出结论，确诊往往依赖于实验室诊断。而儿童疾病的特点是起病急、转归快，因此敏感、快速、实用的Mc检测对及早进行有效的临床干预具有非常重要的意义。
[0005]尽管Mc在全球范围内传播，但可用于实验室诊断的标准化商品试剂的种类极少。目前，Mc感染的诊断方法有血清学检测法，核酸检测法和病原体直接检测法。
[0006]检测血清中Mc IgG、IgA、IgM抗体常用的方法有:微量免疫荧光抗体检测(MIF)，补体结合试验(CF)，重组酶免疫测定(rEIA)，血清补体结合一酶免疫测定试验(SeroCF—EIA)等。然而Mc抗体的检出只能说明该个体感染过Mc,却不能反映体内是否仍有Mc活菌存在，并且血清学特异性抗体检测常需要根据IgM抗体的动态结果进行判断，需要较长的时间。同时，这些技术均存在灵敏度低、操作步骤复杂、需要专业人员操作、重复性差、检测时间长、检测特异性差、成本较高等缺陷，因而难以满足临床的实际需要。
[0007]核酸检测包括核酸杂交和聚合酶链式反应(PCR)，核酸杂交检测Mc的特异性强，但敏感性不高，主要用于PCR结果的检测、判定，尚未直接用于临床标本的检测；PCR具有较高的敏感性，但PCR实验对实验室有特殊要求，标本处理、扩增和检测要求严格，且易出现假阳性，在我国还不能作为常用的临床诊断方法。
[0008]病原体检测方法主要为病原分离培养法，将标本接种于血平板，35?37°C，于含5%二氧化碳(CO2)孵箱中孵育16?20h，再根据菌落形态、革兰染色及生化鉴定(氧化酶阳性、葡萄糖阴性，DNA酶、硝酸盐还原酶阳性)确定为卡他莫拉菌。该法为检测卡他莫拉菌感染的“金标准”，但其存在操作步骤复杂，检测时间长等明显缺陷，并不十分适合临床应用。
[0009]因此，目前建立具高灵敏度、高特异性的卡他莫拉菌抗原快速检测法以满足临床的检测需求就显得非常必要了。
实用新型内容
[0010]本实用新型针对【背景技术】中现存的几种卡他莫拉菌在检测方式中遇到的技术瓶颈，提出了一种具有操作简便、检测快速、可定量及高灵敏度等优点的卡他莫拉菌量子点免疫层析检测卡。
[0011]本实用新型的目的是通过以下技术手段来实现的:
[0012]—种卡他莫拉菌量子点免疫层析检测卡,其特征在于:所述卡他莫拉菌量子点免疫层析检测卡包括底板、样品垫、结合垫、检测层以及吸水垫；所述结合垫包被有量子点标记的抗卡他莫拉菌纳米探针；所述检测层是由带有一条检测线及一条质控线的固相硝酸纤维素膜构成；所述检测线包被有鼠抗卡他莫拉菌UspAl蛋白多克隆抗体；所述质控线包被有抗兔IgG ;所述检测层粘贴在底板上；所述结合垫以及吸水垫分别设置在检测层两端部的上方且与检测层部分重叠后分别与检测层以及底板粘贴在一起；所述样品垫设置在结合垫上方且与结合垫部分重合后分别与结合垫及底板粘贴在一起。
[0013]作为优选，本实用新型所采用的量子点是羧基化两亲聚合物修饰的水溶性CdSe/ZnS量子点。
[0014]作为优选，本实用新型所采用的抗兔IgG包括但不限于羊抗兔IgG。
[0015]作为优选，本实用新型所采用的检测层长2cm，所述检测层粘贴在长度是
6.6-7.7cm的底板表面中间段；所述检测层与粘贴在检测层以及底板上的且长度是
2.5-3cm的吸水垫重叠0.2-0.4cm ;所述检测层与粘贴在检测层以及底板上的且长度是0.5-0.8cm的结合垫重叠0.2-0.4cm ;所述结合垫与粘贴在结合垫以及底板上的长度是
2.5cm的样品垫重叠0.2一0.4cm ;所述检测线与质控线的间距是0.5-0.8cm ;所述底板的宽度是 0.3—0.5cm。
[0016]作为优选，本实用新型所采用的吸水垫是吸水滤纸；所述底板是PVC板。
[0017]与现有技术相比，本实用新型具有如下优点:
[0018]1、本实用新型的检测卡是将免疫层析与量子点标记技术综合起来，利用本实用新型制备的高效价、高特异性多克隆抗体，通过激发荧光来对样品进行检测，具有灵敏度高的特点(其对卡他莫拉菌的检测底线为3 X 104CFU/ml)，用其对临床样品的检测结果与目前对该病原体的检测“金标准”-培养法的相比无统计学差异。
[0019]2、本实用新型所用的抗体均是识别卡他莫拉菌特异性UspAl抗原胞外保守区的多克隆抗体，其特异性高，同时其较目前最广泛使用的单克隆抗体而言制备成本低廉，因此，本实用新型检测成本较低。
[0020]3、本实用新型检测方法简单，检测快速，易于判定，结果判定在20分钟内完成，既可以用紫外检测仪进行定性检测，亦可结合CCD扫描等技术进行定量检测，检测成本低廉，克服了现有技术GnELISA)检测成本高、操作复杂繁琐、耗时长、且必需专业人员才能操作的不足。
[0021]4、由于检测卡检测的是卡他莫拉菌抗原而非抗体(抗体的出现需要感染几天至几周以后)，故该方法在卡他莫拉菌的早期临床诊断和防治、病原体亚型鉴别、流行病学调查等方面具有很高的实用价值。
[0022]5、由于本实用新型首次以卡他莫拉菌所独有的表面蛋白UspAl作为抗原标靶，而该抗原不仅存在于所有类型的卡他莫拉菌细胞表面，且保守性高，属于卡他莫拉菌特异性抗原，因此本实用新型可高度特异性的检测所有类型卡他莫拉菌的感染。而市场上目前未见任何一种与本检测卡一样能快速检测所有类型卡他莫拉菌的工具存在。
[0023]6、本实用新型检测方法所用的临床样本为呼吸道分泌物如痰液等，而非血液，可免除婴幼儿患者抽血检查的痛苦与家长的心理负担，故较易于推广。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1是本实用新型所提供检测卡的纵向剖面结构示意图；
[0025]图2是本实用新型所提供检测卡的在完成组装后的结构示意图；
[0026]其中:
[0027]1-样品塾；2_结合塾；3_检测层；4_检测线；5_质控线；6_吸水塾；7_底板。
【具体实施方式】
[0028]本实用新型的工作原理是:本实用新型是在免疫层析测定法(双抗体夹心)的前提下，以多克隆抗体为基础，采用量子点标记探针技术，通过量子点标记技术研制检测卡他莫拉菌抗原的量子点免疫层析检测卡。首先是兔抗卡他莫拉菌UspAl蛋白多克隆抗体和鼠抗卡他莫拉菌UspAl蛋白多克隆抗体的制备、纯化以及量子点标记，其次为喷膜，然后将检测卡各组成成分进行组装，最后制备卡他莫拉菌量子点免疫层析检测卡。本实用新型所提供的检测卡具有敏感、快速和特异性好等特点，并且可定量检测，能进行样品的高通量筛查，具有较好的市场应用前景。
[0029]如附图1所示，本实用新型所提供了一种卡他莫拉菌量子点免疫层析检测卡，包括样品垫1、结合垫2、检测层3、吸水垫6及底板7组成。结合垫2上包被有量子点标记的抗卡他莫拉菌纳米探针；检测层3是喷有检测线4以及质控线5的固相硝酸纤维素膜简称NC膜；检测线4包被有鼠抗卡他莫拉菌UspAl蛋白多克隆抗体；质控线5包被有抗兔IgG ；量子点为羧基化两亲聚合物修饰的水溶性CdSe/ZnS量子点；吸水垫6材质为吸水滤纸；底板7材质为PVC。
[0030]其具体结构是:检测层长2cm，检测层粘贴在长度是6.6-7.7cm的底板表面中间段；检测层与粘贴在检测层以及底板上的且长度是2.5-3cm的吸水垫重叠0.2-0.4cm ;检测层与粘贴在检测层以及底板上的且长度是0.5-0.8cm的结合垫重叠0.2-0.4cm ;结合垫与粘贴在结合垫以及底板上的长度是2.5cm的样品垫重叠0.2—0.4cm ;检测线与质控线间距是0.5_0.8cm ;底板的宽度是0.3_0.5cm。
[0031]其中，上述参数优选方案是:检测层3长2cm，粘贴在底板7长7.3cm表面中间段，此检测层右端与粘贴在底板7右末端的吸水垫6长3cm重叠0.2cm,其另一端与结合垫2长0.6cm重叠0.3cm ;结合垫2则与粘贴在底板7左端的样品垫(I)长2.5cm重叠0.3cm ;检测层3上的检测线4及质控线5间距0.7cm。整条检测卡的宽度为0.4cm。
[0032]制备上述卡他莫拉菌量子点免疫层析检测卡的方法，其主要步骤包括:
[0033]一、结合垫的制备
[0034](I)重组UspAl-His融合蛋白的制备、纯化:
[0035]对卡他莫拉菌UspAl蛋白进行生物信息学分析,获取卡他莫拉菌UspAl蛋白胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段，找到其对应的基因序列；在此基因序列的5’端及3’端分别引入酶切位点并化学合成全基因序列，同时标记记为UspAl。将该基因序列按常规方法克隆入表达载体pET-28a(+)后表达重组UspAl-His融合蛋白。此融合蛋白以包涵体表达形式存在于基因工程菌体中。用镍柱纯化基因工程菌菌体中的重组UspAl-His融合蛋白，SDS-PAGE检测其纯度后，再以Bradford法测定蛋白质浓度，调整蛋白浓度为0.2mg/mL后备用；
[0036](2)兔及鼠抗卡他莫拉菌UspAl蛋白多克隆抗体IgG的制备:
[0037]以纯化的重组UspAl-His融合蛋白为完全抗原，按常规方法免疫新西兰大白兔及豚鼠，分别制备兔抗卡他莫拉菌UspAl蛋白抗血清及鼠抗卡他莫拉菌UspAl蛋白抗血清。该二种抗血清的间接ELISA效价均大于IX 15,用Protein G亲和层析柱分别纯化二种抗血清中的多克隆抗体IgG，用凯基Braford蛋白含量检测试剂盒测定抗体浓度并均调整为3mg/mL后备用。其中兔抗卡他莫拉菌UspAl蛋白多克隆抗体IgG用作量子点标记试验；鼠抗卡他莫拉菌UspAl蛋白多克隆抗体IgG用作检测线的包被。
[0038](3)量子点标记的抗卡他莫拉菌纳米探针的制备与纯化
[0039]其操作步骤如下:向微量离心管中依次加入2nmol量子点、300nmol N-轻基琥拍酰亚胺(sulfo-NHS)和300nmol碳二亚胺(EDC)，以磷酸盐缓冲液(2.9g/L磷酸氢二钠，
0.295g/L磷酸二氢钠，2g/L氯化钠，pH7.3)定容为2ml,于旋转混合仪中，以15rpm/min,37V反应30min后，透析去除过量的活化剂(sulfo-NHS与EDC)。在活化的量子点中，加入4-12nmol (优选为6nmol)的步骤(2)所制备的兔抗卡他莫拉菌UspAl蛋白多克隆抗体IgG,避光反应2h，加入端氨基化聚乙二醇(PEG2000-NH2)至终浓度为1.5%，封闭未反应的活化羧基位点，继续避光反应lh。用0.2ym PES滤器过滤除去抗体聚集物，然后将滤液转移到50000MW超滤离心管中，以8000g离心力在4°C下离心15min，除去未发生偶联反应的抗体和反应中的副产物。收集超滤管滤膜上层量子点-抗体偶联物溶液，溶于2ml磷酸盐洗涤液(2.9g/L磷酸氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠，2g/L氯化钠，5ml/L吐温-20，lg/L叠氮钠，pH7.3)中，再将此溶液转移到50000MW超滤离心管中，以8000g离心力在4°C下离心15min，收集超滤管滤膜上层量子点-抗体偶联物溶液，溶于Iml磷酸盐保存液(2.9g/L磷酸氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠，2g/L氯化钠，10g/L BSA, lg/L叠氮钠，pH7.3)中，制得量子点标记的抗卡他莫拉菌纳米探针。
[0040](4)量子点标记抗体的负载
[0041]将聚酯纤维膜浸入步骤(3)所得到的量子点标记的抗卡他莫拉菌纳米探针溶液中Ih,取出，25°C干燥后裁成4cm*0.6cm的规格后4°C密封保存备用，至此制得结合垫。
[0042]二、样品垫的制备
[0043]取玻璃纤维素膜一张，将其在样品垫处理液(2.9g/L磷酸氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠，2g/L氯化钠，20g/L牛血清白蛋白(BSA), 10ml/L吐温-20，20g/L蔗糖，5g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP-10)，pH7.3)中浸泡至少3h以上，再置于生物安全柜内37°C通风干燥后，剪裁成4cm*2.5cm的规格，25°C密封干燥保存。至此制得样品垫。经试验证实玻璃纤维素膜经该种方法处理后，显著地提高了量子点标记抗体的释放率。
[0044]三、检测层的制备
[0045]检测层的制备，是通过分别将由步骤一中所制备的鼠抗卡他莫拉菌UspAl蛋白多克隆抗体IgG和抗兔IgG用专用的喷膜机在硝酸纤维素膜上形成检测线和控制线；其具体制备方法包括如下步骤:
[0046]将步骤一中制备的鼠抗卡他莫拉菌UspAl蛋白多克隆抗体IgG和抗兔IgG用磷酸盐缓冲液(2.9g/L磷酸氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠，2g/L氯化钠，pH7.3)分别均调整至终浓度为0.5-2.5mg/mL，其中鼠抗卡他莫拉菌UspAl蛋白多克隆抗体IgG优选的稀释终浓度为1.5-2.0mg/mL,抗兔IgG优选的稀释终浓度为0.5-1.5mg/mL。将稀释好的鼠抗卡他莫拉菌UspAl蛋白多克隆抗体IgG装入B1DOT划膜仪喷头中，设置0.8-2.5 μ 1/cm，优选为
1.0-2.0 μ 1/cm的量喷于硝酸纤维素膜上，形成检测线；将稀释好的抗兔IgG装入B1DOT划膜仪喷头中，设置0.8-2.5 μ I/cm,优选为1.0-2.0 μ 1/cm的量喷于硝酸纤维素膜上作为质控线，其与检测线间距为0.7cm。将喷好的硝酸纤维素膜37°C干燥2h，剪裁成4cm*4cm的规格，4°C密封干燥保存。至此制得检测层。
[0047]四、底板的加工
[0048]将PVC材质的底板裁剪成4cm*7.3cm的规格后备用。
[0049]五、吸水垫的制备
[0050]将吸水滤纸裁剪成4cm*3cm的规格，即制成吸水垫，备用。
[0051]六、检测卡的组装
[0052]组装工作于生物安全柜内操作，首先将步骤四所述的底板上的粘性保护膜揭掉，将上文步骤三所述的检测层(即带有I条质控线和I条检测线的硝酸纤维素膜)粘贴到底板的中部区域，并小心抹平膜面。其次，将上文步骤五所述的吸水垫组装到底板上，使其左边与检测层有0.2 Cm的重叠，同时将其右边缘与底板的右边缘对齐粘好并小心抹平。再将上文步骤一所述的结合垫按0.3cm重叠于硝酸纤维素膜的左边缘处，0.3cm粘于底板上。最后将上文步骤二所述的样品垫则按一边0.3cm重叠于结合垫的左边缘处，另一边与底板的左边缘对齐，粘于底板上并小心抹平。将组装好的检测板于切条机下裁成4.0mm宽的检测卡，4°C密封干燥避光保存。至此制得卡他莫拉菌量子点免疫层析检测卡。
[0053]上述卡他莫拉菌量子点免疫层析检测卡的使用方法，步骤如下:
[0054]将待检样品(如咽拭子等)用500 μ I的样品处理液(2.9g/L磷酸氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠，10mL/L Triton x-100，2g/L氯化钠，ρΗ7.3)充分溶解后，取出120yL滴于检测卡的样品垫上，15分钟后于紫外灯下观察检测结果。若待检样品中含有卡他莫拉菌抗原，则与结合垫中的量子点标记的抗卡他莫拉菌纳米探针结合，通过层析作用先与硝酸纤维素膜上的鼠抗卡他莫拉菌UspAl蛋白多克隆抗体结合后在紫外线激发下在检测线处会形成肉眼可见的一条荧光检测线，未结合完的量子点标记抗体继续层析与抗兔IgG结合后在紫外线激发下形成肉眼可见的第二条荧光质控线；若待检样品中无相关抗原，则仅出现一条荧光质控线。如果荧光质控线未出现，则该检测卡失效。
[0055]本实用新型所需的羧基化两亲聚合物修饰的水溶性CdSe/ZnS量子点可到例如武汉珈源量子点技术开发有限公司等专业性公司购买；所需的PVC材质底板、吸水滤纸、硝酸纤维素膜、聚酯纤维膜、玻璃纤维素膜等可到Millipore及上海金标生物科技有限公司等专业性公司购买，所需的其他常规仪器、设备、生化药品均有市售。
[0056]本实用新型通过以下实施例作进一步具体描述。
[0057]本实用新型使用或采用的各种材料的来源及相关试剂的配制
[0058]1、样品垫处理液:称取0.29g磷酸氢二钠，0.0295g磷酸二氢钠，0.2g氯化钠，2g牛血清白蛋白(BSA)，Iml吐温-20，2g蔗糖，0.5g聚乙烯吡咯烷酮(PVP-10)，溶解于90ml的去离子水中，用lmol/L NaOH调pH至7.3后用去离子水定容至100ml。
[0059]2、磷酸盐洗涤液:称取0.29g磷酸氢二钠，0.0295g磷酸二氢钠，0.2g氯化钠，
0.5ml吐温-20，0.1g叠氮化钠，溶解于90ml的去离子水中，用Imol/LNaOH调pH至7.3后用去离子水定容至100ml。
[0060]3、磷酸盐保存液:称取0.29g磷酸氢二钠，0.0295g磷酸二氢钠，0.2g氯化钠，Ig牛血清白蛋白(BSA)，0.1g NaN3，溶解于90ml的去离子水中，用lmol/L NaOH调pH至7.3后用去离子水定容至100ml。
[0061]4、磷酸盐缓冲液(PBS):称取0.29g磷酸氢二钠，0.0295g磷酸二氢钠，0.2g氯化钠，溶解于90ml的去离子水中，用lmol/L NaOH调pH至7.3后用去离子水定容至100ml。
[0062]5、兔抗卡他莫拉菌UspAl蛋白多克隆抗体IgG:为本实用新型自制，用PBS稀释，摇匀，使溶液中多克隆抗体浓度为3mg/ml。
[0063]6、鼠抗卡他莫拉菌UspAl蛋白多克隆抗体IgG:为本实用新型自制,用PBS稀释，摇匀，使溶液中多克隆抗体浓度为3mg/ml。
[0064]7、羊抗兔IgG:为博士德公司产品，用PBS稀释，摇匀，使溶液中多克隆抗体浓度为lmg/ml。
[0065]8、量子点:本实用新型中所用量子点为羧基化两亲聚合物修饰的水溶性CdSe/ZnS量子点，其发射波长为565nm，购买自武汉珈源量子点技术开发有限公司，产品名称为羧基水溶性量子点-565。
[0066]9、玻璃纤维素膜:厚度为0.4mm,吸水量为42mg/cm2，玻璃纤维直径为0.6-3 μ m，具有良好的亲水性，购买于上海金标生物科技有限公司(型号为BT40)。
[0067]10、聚酯纤维膜:厚度为0.48mm，吸水速度为18s/4cm，具有极好的亲水性，用于结合垫的制备，购买于上海金标生物科技有限公司(型号为DL42)。
[0068]11、硝酸纤维素膜:型号为Millipore Corp SHF135,有衬板,购买于Millipore公司。
[0069]12、吸水滤纸:厚度为0.95mm,吸水速度为60s/4cm，吸水量为700mg/cm2，具有良好的吸水性，作为制作吸水垫的材料。购买于上海金标生物科技有限公司(型号为CH37K)。
[0070]13、底板:为高白度PVC材质，表面涂布单层高聚合物压敏胶SM31，购买于上海金标生物科技有限公司。
[0071]14、卡他莫拉菌菌株:购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，编号为ATCC25238。
[0072]15、本实用新型所用到的微生物样品均购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。
[0073]下面结合实施例对本实用新型所提供的技术方案进行详细说明:
[0074]实施例1 (制备实施例)
[0075]结合垫的制备
[0076](一 )重组UspAl-His融合蛋白的制备、纯化
[0077]1.相关基因的克隆
[0078]对卡他莫拉菌表面蛋白UspAl (其NCBI蛋白质数据库中的access1n number为AAF36416)进行生物信息学分析，获取其胞外保守结构域中抗原表位最为丰富的肽段，找到其对应的DNA编码序列，同时在其5’引入酶切位点Nde1、3’端引入终止信号TAA和酶切位点XhoI后化学合成全基因序列(全序列合成交由金斯瑞生物科技有限公司完成,交货时人工合成的基因片段连于载体PUC57上)，记为UspAl。具体的说，UspAl基因编码的蛋白质序列为天然卡他莫拉菌表面蛋白UspAl (access1n number:AAF36416)的522_710aa。将含有该段人工合成的DNA片段的载体pUC57用NdeI及XhoI进行双酶切后按常规方法回收目的片段，备用。同时采用NdeI及XhoI对载体pET-28a(+)进行双酶切，并按常规方法将经双酶切后获得的UspAl基因连入pET-28a(+)载体中，并转化大肠杆菌T0P10，构建pET_UspAl表达载体。经酶切和序列测定证实表达载体构建无误。该载体表达重组UspAl-His融合蛋白。
[0079]2.重组UspAl-His融合蛋白的表达与纯化
[0080]将鉴定正确的阳性克隆菌培养后提取质粒，按常规技术转入感受态E.coliBL21(DE3)中，转化完成后将菌液涂布于含50 μ g/mL卡那霉素的LB平板上，按常规方法筛选表达菌株。挑取pET-UspAl转化的具有外源蛋白表达能力的单个菌落并接种入10mL LB培养基中，于37°C培养过夜。取出菌液后，按1:100接种于10mL含有50 μ g/mL卡那霉素的LB培养基中，于37°C培养至OD6tltl = 0.6时，加入lmol/L IPTG至终浓度为lmmol/L,于37°C摇菌培养,诱导融合蛋白表达。诱导4h后分别于8000r/min下离心1min收集菌体。将菌体用20mL PBS缓冲液洗涤3次并再次重悬后进行超声破碎，操作条件为:50HZ，200W，超声3S，间歇5S，工作100次。超声完成后，12000g离心15min收集沉淀，即为包涵体。将此包涵体用洗涤缓冲液(20mM Na3PO470.5M NaCl ;3M尿素，30mM咪唑，pH7.4)洗漆两次后，12000g离心15min收集沉淀。将沉淀用Binding buffer (20mM Na3PO4, 0.5MNaCl ；8M尿素，30mM咪唑，pH7.4)于室温下溶解后，12000g离心15min，上清用0.45 μ m的滤膜进行过滤。此溶解液中的重组蛋白用His Trap affinity columns (GE healthcare公司产品)，按照说明书的方法进行纯化。具体方法如下:
[0081]I)用5mL注射器吸满蒸馏水，拧开柱的塞子，用提供的接头将柱和注射器连接上，以lmL/min流速洗柱。
[0082]2)用 10mT, Binding buffer 平衡，lmL/min 流速。
[0083]3)将融合蛋白上样，lmL/min流速。
[0084]4)用 10mT, Binding buffer,以 lmL/min 流速洗柱。
[0085]5)用 1mL Elut1n buffer (20mM Na3PO4,0.5M NaCl ;8M 尿素，500mM 咪唑，PH7.4)，以I mL/min流速洗脱，分管收集，每管1ml，12% SDS-PAGE检测，合并洗脱组分中含有目的蛋白的样品。经bradford试剂盒进行蛋白质浓度测定后,调整浓度为0.2mg/mL。
[0086]( 二)兔及鼠抗卡他莫拉菌UspAl蛋白多克隆抗体IgG的制备
[0087]1.兔抗卡他莫拉菌UspAl蛋白多克隆抗体IgG的制备
[0088]用步骤(一)纯化的重组UspAl-His融合蛋白按照200μ g(lmL)与ImL弗氏完全佐剂混匀乳化后免疫雄性新西兰大白兔(由湖北省疾病预防控制中心提供)，于背部皮下多点注射，间隔7d后再免疫一次，再过14 d后用上述纯化的重组UspAl-His融合蛋白按照200 μ g (ImL)与ImL弗氏不完全佐剂混匀乳化后进行加强免疫，加强免疫7d后再按上述同样方法再加强免疫一次。7d后取血分析抗体滴度。若不满意，可重复进行一到两次加强免疫，至抗体滴度满意(用ELISA法测定抗体效价大于I XlO5)。若满意则心脏采血，分离血清，以Protein G亲和层析柱(GE healthcare公司产品)，严格按照操作说明书纯化多克隆抗体IgG,用凯基Braford蛋白含量检测试剂盒测定抗体浓度并用磷酸盐缓冲液(8g/LNaCL, 0.2g/L KC1，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4 pH7.4)调整为 lmg/mL，_20°C保藏备用，至此制得兔抗卡他莫拉菌UspAl蛋白多克隆抗体IgG。Westenblot试验表明，此多克隆抗体IgG能特异性识别卡他莫拉菌全长UspAl蛋白。
[0089]2.鼠抗卡他莫拉菌UspAl蛋白多克隆抗体IgG的制备
[0090]用步骤(一)纯化的重组UspAl-His融合蛋白作为完全抗原免疫豚鼠(由湖北省疾病预防控制中心提供)，肩胛下注射抗原200 μ g/只。基础免疫为等体积的抗原与弗氏完全佐剂进行乳化，每隔2周进行一次加强免疫，加强免疫用等体积抗原与等体积弗氏不完全佐剂进行乳化，总共免疫4次。末次免疫1d后取血分析抗体滴度。若不满意，可重复进行一到两次加强免疫，至抗体滴度满意(用ELISA法测定抗体效价大于I XlO5)。若满意则处死豚鼠取血清，以Protein G亲和层析柱(GE healthcare公司产品)，严格按照操作说明书纯化多克隆抗体IgG，用凯基Braford蛋白含量检测试剂盒测定抗体浓度并用磷酸盐缓冲液(8g/L NaCL, 0.2g/L KC1，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HP04pH = 7.4)调整为 lmg/mL,备用，至此制得鼠抗卡他莫拉菌UspAl蛋白多克隆抗体IgG。Westen blot试验表明,此多克隆抗体IgG能特异性识别卡他莫拉菌全长UspAl蛋白。
[0091](三)量子点标记的抗卡他莫拉菌纳米探针的制备
[0092]1.纳米羧基量子点标记兔抗卡他莫拉菌UspAl蛋白多克隆抗体IgG反应条件的优化:
[0093]1.1、羧基量子点标记抗体探针最佳标记pH的确定
[0094]将标记反应中磷酸盐缓冲液pH分别设为5，6，7，8，9，对标记产物利用全光谱仪进行荧光强度测定，观察不同PH值对偶联反应的影响，确定了量子点标记多抗反应的最佳pH为7.0-8.0。本实验选择pH7.4。
[0095]1.2、羧基量子点标记抗体探针最佳标记量的确定
[0096]将量子点摩尔浓度与多抗浓度之比分别设置为1:1，1:2，1:3及1:4，进行标记反应后，对标记产物利用全光谱仪进行荧光强度测定，观察二者不同浓度比对偶联反应的影响，确定量子点标记兔抗卡他莫拉菌UspAl蛋白多克隆抗体IgG反应的最佳摩尔浓度比为量子点与抗体摩尔比为1:3。本实验选择该最优浓度比来确定标记量。
[0097]1.3、羧基量子点标记抗体探针最佳封闭剂种类的确定
[0098]以乙醇胺、Tris, PEG2000-NH2或者BSA作为封闭剂，按步骤1.1及1.2确定的条件进行标记反应后，对标记产物利用全光谱仪进行荧光强度测定，观察不同的封闭剂对于标记反应的影响，结果发现，PEG2000-NH2为最佳封闭剂，其可显著提高标记复合物的胶体稳定性及免疫活性。
[0099]2.标记过程:
[0100]向微量离心管中依次加入2nmol羧基水溶性量子点、300nmol N-羟基琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)和300nmol碳二亚胺(EDC)，以磷酸盐缓冲液(2.9g/L磷酸氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠，4g/L氯化钠，pH7.4)定容为2ml，不停地混合溶液，37 °C反应30min后，透析去除过量的作为活化剂的sulfo-NHS与EDC。在活化的量子点中，加入6nmol的步骤(二)制备的的兔抗卡他莫拉菌UspAl蛋白多克隆抗体IgG,避光反应2h,加入单端氨基化聚乙二醇(PEG2000-NH2)至终浓度为1%，封闭未反应的活化羧基位点，继续避光反应lh。用0.2μπιPES滤器过滤除去抗体聚集物，然后将滤液转移到50000MW超滤离心管中，以8000g离心力在4°C下离心15min，除去未发生偶联反应的抗体和反应中的副产物。收集超滤管滤膜上层量子点-抗体偶联物溶液，溶于2ml磷酸盐洗涤液(2.9g/L磷酸氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠，4g/L氯化钠，5ml/L吐温-20，0.3g/L叠氮钠，pH7.4)中，再将此溶液转移到50000MW超滤离心管中，以SOOOg离心力在4°C下离心15min，收集超滤管滤膜上层量子点-抗体偶联物溶液，溶于Iml磷酸盐保存液(2.9g/L磷酸氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠，2g/L氯化钠，10g/L BSA, 0.3g/L叠氮钠，pH7.4)中，至此制得量子点标记的抗卡他莫拉菌纳米探针,置于4 °C保存备用。
[0101](四)量子点标记的抗卡他莫拉菌纳米探针的负载
[0102]将聚酯纤维膜浸入步骤(三)所得到的量子点标记的抗卡他莫拉菌纳米探针溶液中Ih,取出，25°C干燥后裁成后规格为4cm*0.6cm/条后，4°C密封保存备用，至此制得结合垫。
[0103]实施例2 (制备实施例)
[0104]样品垫的制备
[0105]配制不同配方的样品垫处理液，观察量子点标记抗体的释放效果，通过多次正交试验优化，得到最优的样品垫处理液配方(即本实用新型所述)。取玻璃纤维素膜一张，将其在样品垫处理液中浸泡至少3h，再置于生物安全柜内37°C通风干燥后，剪裁成规格为4cm*2.5cm/条后，即制得样品垫，25°C密封干燥保存。经试验证实该样品垫的使用，大大提高了结合垫上量子点标记抗体的释放率，达到了较好的应用效果。
[0106]实施例3 (制备实施例)
[0107]检测层的制备
[0108]将硝酸纤维素膜剪成4cm*4cm大小。将实施例1中所制备的鼠抗卡他莫拉菌UspAl蛋白多克隆抗体IgG和抗兔IgG用磷酸盐缓冲液调整至终浓度分别为2.0mg/mL及1.0mg/mL。将稀释好的鼠抗卡他莫拉菌UspAl蛋白多克隆抗体IgG装入B1DOT划膜仪喷头中，设置1.0 μ 1/cm的量喷于硝酸纤维素膜上，形成检测线；将稀释好的抗兔IgG装入B1DOT划膜仪喷头中，设置1.0μ Ι/cm的量喷于硝酸纤维素膜上作为质控线，其与检测线间距为0.7cm。将喷好的硝酸纤维素膜37°C干燥2h，剪裁成4cm*4cm的规格，4°C密封干燥保存。至此制得检测层。
[0109]实施例4 (制备实施例)
[0110]检测卡的组装
[0111]下面结合附图1及附图2对检测卡的组装作进一步说明。
[0112]将底板裁剪成4cm*7.3cm大小，备用。
[0113]将吸水滤纸裁剪成4cm*3cm大小,作为吸水垫,备用。
[0114]组装工作于生物安全柜内操作，首先将底板7上的粘性保护膜揭掉，将实施例3所述的检测层3即带有质控线5和检测线4的硝酸纤维素膜粘贴到底板7上附图1所指的具体区域，并小心抹平膜面。其次，将事先裁好的吸水垫6组装到底板7上，使其左边与检测层右末端有0.2cm的重叠，其右边缘则与底板7的右边缘对齐粘好并小心抹平。再将实施例I所描述的结合垫2按0.3cm重叠于检测层3的左边缘处，0.3cm粘于底板7上。最后将实施例2所描述的的样品垫I则按一边0.3cm重叠于结合垫2的左边缘处，另一边与底板7的左边缘对齐，粘于底板7上并小心抹平。将组装好的检测板于切条机下裁成4.0mm宽的检测卡，4 °C密封干燥避光保存。
[0115]实施例5 (应用实施例)
[0116]检测卡的使用方法
[0117]按常规方法获得待检者的咽拭子，将其插入装有500 μ I的添加了 I % Tritonx-100(体积百分比)的磷酸盐缓冲液(PBST)的软质塑料管中，挤压塑料管壁，使拭子上的样品充分溶解后，取出120 μ L滴于检测卡的样品垫上，15分钟后于紫外分析仪下(型号为WD-9403A，北京六一仪器厂生产，紫外激发波长365nm)观察检测结果。若咽拭子中含有卡他莫拉菌抗原，则与结合垫中的量子点标记的抗卡他莫拉菌纳米探针结合，通过层析作用先与硝酸纤维素膜上的鼠抗卡他莫拉菌UspAl蛋白多克隆抗体结合后在紫外线激发下在检测线处会形成肉眼可见的一条荧光检测线，未结合完的量子点标记抗体继续层析与抗兔IgG结合后在紫外线激发下形成肉眼可见的第二条荧光质控线；若待检咽拭子中无相关抗原，则仅出现一条荧光质控线。如果荧光质控线未出现，则该检测卡失效。
[0118]实施例6 (应用实施例)
[0119]本实用新型的应用效果举例
[0120]本实施例中所指的卡他莫拉菌量子点免疫层析检测卡的使用方法参照实施例5所述的操作步骤。
[0121]I)特异性试验
[0122]用呼吸道常见病原体如人呼吸道合胞病毒(Long株，ATCC编号VR26)、人肺炎支原体(ATCC编号15531)、人肺炎衣原体(AR-39株，ATCC编号53592)、人腺病毒3型(GB株，ATCC编号VR-3)、人腺病毒7型(Gomen株，ATCC编号VR-7)、人甲型流感病毒(H1N1，ATCC编号VR-1743)、人乙型流感病毒(ATCC编号VR-790)、流感嗜血杆菌(ATCC编号53781)、肺炎链球菌(ATCC编号700670)等代替卡他莫拉菌进行检测，检测卡检测含这些微生物的PBST稀释液都为阴性。
[0123]2)敏感性试验
[0124]通过测定卡他莫拉菌培养物稀释液来做敏感性研究，确定实施例4所述的检测卡检测卡他莫拉菌亚型菌株(ATCC编号25238)的检测下限为3 X 104CFU/ml。
[0125]3)临床测试例
[0126]以卡他莫拉菌检测“金标准培养法作为参照，取96例呼吸科呼吸道感染者的咽拭子标本用实施例4所描述的检测卡进行检测，培养法阳性率为15.6% (15/96)，本检测卡% 14.6% (14/96)，2种方法的符合率为96.9% (93/96)。具体结果如表I所示。
[0127]表I临床标本的检测结果
[0128]本检测卡
痰培养法阳性阴性总计
阳性 13 215
阴性 I 8081
总计 14 8296
[0129] 需要指出的是，以上所述仅为本实用新型的较佳实施例而已，并不用以限制本实用新型，凡在本实用新型精神和原则之内所做的任何修改、等同替换等均应包含在本实用新型的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种卡他莫拉菌量子点免疫层析检测卡,其特征在于:所述卡他莫拉菌量子点免疫层析检测卡包括底板、样品垫、结合垫、检测层以及吸水垫；所述结合垫包被有量子点标记的抗卡他莫拉菌纳米探针；所述检测层是由带有一条检测线及一条质控线的固相硝酸纤维素膜构成；所述检测线包被有鼠抗卡他莫拉菌UspAl蛋白多克隆抗体；所述质控线包被有抗兔IgG ;所述检测层粘贴在底板上；所述结合垫以及吸水垫分别设置在检测层两端部的上方且与检测层部分重叠后分别与检测层以及底板粘贴在一起；所述样品垫设置在结合垫上方且与结合垫部分重合后分别与结合垫及底板粘贴在一起。
2.根据权利要求1所述的卡他莫拉菌量子点免疫层析检测卡，其特征在于:所述量子点是羧基化两亲聚合物修饰的水溶性CdSe/ZnS量子点。
3.根据权利要求1或2所述的卡他莫拉菌量子点免疫层析检测卡，其特征在于:所述抗兔IgG包括但不限于羊抗兔IgG。
4.根据权利要求3所述的卡他莫拉菌量子点免疫层析检测卡，其特征在于:所述检测层长2 cm，所述检测层粘贴在长度是6.6-7.7 cm的底板表面中间段；所述检测层与粘贴在检测层以及底板上的且长度是2.5-3 cm的吸水垫重叠0.2-0.4 cm ;所述检测层与粘贴在检测层以及底板上的且长度是0.5-0.8 cm的结合垫重叠0.2-0.4 cm ;所述结合垫与粘贴在结合垫以及底板上的长度是2.5 cm的样品垫重叠0.2—0.4 cm ;所述检测线与质控线的间距是0.5-0.8 cm ;所述底板的宽度是0.3-0.5 cm。
5.根据权利要求4所述的卡他莫拉菌量子点免疫层析检测卡，其特征在于:所述吸水垫是吸水滤纸；所述底板是PVC板。
【文档编号】G01N33/531GK204028085SQ201420465563
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年8月18日 优先权日:2014年8月18日
【发明者】胡征, 杨波, 董俊 申请人:董俊