本发明涉及生物技术领域，具体是一种奶牛孕酮elisa检测试剂盒。
背景技术：
奶牛养殖业是我国畜牧养殖业中的支柱产业，在奶牛养殖业中，繁殖效率是决定牛群经济效益的关键因素之一。孕酮(progesterone，p4)是奶牛排卵后卵巢中形成的黄体和妊娠期胎盘产生的一种甾体激素，反映卵巢活动的精确指示剂，微量的孕酮即能发挥强大的生物效应，因此检测奶牛孕酮含量变化是预防和治疗母畜繁殖障碍性疾病的一种有效方法。
监测奶牛孕酮的含量变化是进行奶牛发情识别、妊娠诊断、人工授精效果监测、繁殖障碍诊断的技术手段。奶牛的繁殖周期中，牛奶孕酮含量的周期性变化直接显示奶牛卵巢的活动状态，因此，本研究建立一种高效、灵敏和特异性的检测方法，奶牛乳汁中孕酮竞争elisa法，进行检测应用。
根据elisa的检测原理，酶联免疫检测技术是将酶促反应的放大作用与抗原-抗体反应的特异性结合起来的一种酶联免疫化学测定法。它既可用于孕酮的定性分析，又可用于定量分析，在妊娠应用中与定性分析为主。此种检测敏感性高、准确性高和检测样品多，用时少，检测迅速，价格低廉。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种特异性高、敏感性强、简便快速的奶牛孕酮elisa检测试剂盒，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种奶牛孕酮elisa检测试剂盒，包括酶标板、标准品、孕酮抗体、酶标二抗、底物反应溶液、终止液、稀释液与洗涤液；其中标准品共7瓶，每瓶800μl，每瓶标准品中孕酮的含量不同，依次为20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml、0ng/ml；孕酮抗体5ml，使用时用稀释液稀释20倍，制得孕酮抗体溶液；底物反应溶液 包括：a液与b液，且a液∶b液的体积比为100∶1，a液为tmb(3，3’，5，5’-tetramethylbenzidine，四甲基联苯胺)工作液，b液为h2o2工作液；酶标二抗5ml，使用时用稀释液稀释20倍，制得酶标二抗溶液。
作为本发明进一步的方案：酶标板为96孔/块，共1块，酶标板内放置干燥剂。
作为本发明进一步的方案：终止液采用h2so4。
作为本发明进一步的方案：稀释液10ml，使用时用蒸馏水稀释10倍。
作为本发明进一步的方案：洗涤液30ml，使用时用蒸馏水稀释10倍。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明通过运用孕酮抗体，建立奶牛孕酮检测方法，研制奶牛孕酮的快速检测试剂盒，具有特异性高、敏感性强、简便快速等优点，为奶牛繁殖状态的监控及提高奶牛繁殖效率提供简便快速的技术手段。
附图说明
图1是本发明实施例1制得的试剂盒的标准曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
奶牛孕酮测定可以用于确定排卵、早期妊娠状态的评价和孕激素治疗监测。通过孕酮检测，预测发情，指导配种。早期妊娠诊断检出漏配和配后未孕奶牛，区分已孕奶牛、休情期奶牛或发情周期不规律的奶牛，以便迅速采取适当的措施。
由于牛奶成分比较复杂，对elisa检测影响较大的是因素是脂肪和蛋白质，因此未去除脂肪和未去除蛋白的样品在elisa检测中可导致吸光值降低，影响检测结果。检测前应对牛奶进行前处理。具体如下所述。
实施例1
1、鲜奶前处理：
将采集的新鲜乳样3000rmp4℃离心20min，弃掉上层脂肪，取下层清液即为样品，进行检测。
2、具体操作步骤：
2.1试剂盒组成成分：
(1)酶标板：1块(96孔/块)，避光密封，内放干燥剂。
(2)标准品：7瓶，每瓶800μl，每瓶标准品中孕酮的含量不同，依次为20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml、0ng/ml。
(3)孕酮抗体：1瓶，5ml。使用时用稀释液稀释20倍，制得孕酮抗体溶液。
(4)酶标二抗：1瓶，5ml。使用时用稀释液稀释20倍，制得酶标二抗溶液。
(5)底物反应溶液：a液，1瓶，10ml。b液，1瓶，1ml。使用时a∶b为100∶1。
(6)终止液：1瓶，5ml。
(7)稀释液：1瓶，10ml，使用时用蒸馏水稀释10倍。
(8)洗涤液：1瓶，30ml，使用时用蒸馏水稀释10倍。
2.2操作步骤：
(1)将4℃冷藏放置的试剂盒取出，室温静置，配制好稀释液和洗涤液及孕酮抗体溶液；
(2)取出酶标板，洗涤液洗涤3次，3min/次，甩干；
(3)将标准品加入酶标板孔内，50μl/孔，将样品加入酶标板的其他孔中，50μl/孔，然后，向上述酶标孔中加入孕酮抗体溶液，50μl/孔，混匀后，37℃静置1h，同时设置非特异性吸附对照孔；
(4)将酶标孔内液体甩干，用洗涤液洗涤3次，3min/次，甩干；
(5)用稀释液配置酶标二抗溶液，加入酶标二抗溶液，100μl/孔，37℃40min；
(6)将酶标孔内液体倒掉，用洗涤液洗涤3次，3min/次，甩干；
(7)按照比例配制底物反应溶液，混匀，100μl/孔，室温避光25min；
(8)向孔内加入h2so4终止液，50μl/孔，在波长450nm处测定od值。
3、建立组装试剂盒的标准曲线
(1)以孕酮浓度的对数为横坐标，logit(b/b0)为纵坐标，建立标准曲线，如图1，建立回归直线相关系数为0.9981，符合相关系数大于0.99的要求。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。