氯霉素药物残留快速检测试纸条的制作方法

本发明涉及一种检测氯霉素药物残留快速检测试纸条，属于食品安全快速检测领域。

技术背景

氯霉素是一种广谱抗生素，常用于动物各种传染病的治疗，对于多种病原菌有较强的抑制作用。氯霉素存在严重的副作用，能抑制人体骨髓造血功能，引起人类的再生障碍性贫血等疾病，因此动物食品中的氯霉素残留对人类的健康构成巨大威胁。

目前有关动物源性食品中氯霉素及其代谢物的测定方法主要为理化检测法，如用化学分析法测定虾肉中的氯霉素残留量，检出限为0.0125ug/kg，用高效液相色谱法测定鱼肉中的氯霉素残留量，检出限为0.0125ug/kg。但这些方法仪器设备昂贵，操作复杂，灵敏度低，且不适用于大批量样品的检测，无法满足国内食品安全检测市场的迫切需要。

免疫分析技术以其抗原抗体反应的高度专一性，以及测定方法简单、快速、灵敏度高、费用低和适于现场大批量样品筛选等优点，在农兽药残留分析中展示了广泛的应用前景。随着农药残留免疫学检测技术不断被完善和商品化，免疫学检测技术会成为食品农兽药残留和食品安全质量控制的有效快速检测手段。基于目前兽药残留诊断试剂的研究现状，及时开发出优于目前的、快速灵敏的检测试剂可谓是当务之急。虽然农兽药残留分析的方法虽然有很多，但是利用免疫学技术进行分析是特异性最好、检测时间最短的方法。

现有技术对于氯霉素的检测主要是气相色谱-质谱法、高效液相色谱法等检测方法，但这些技术的缺陷明显：设备昂贵、操作复杂、难以推广。所以，建立一种简单、有效、适合基层使用的测定方法是极其必要的。本发明的目的是研制一种更适合企业进行现场检测且快捷简便、成本低廉的定性检测方法。

技术实现要素：

本发明的目的:研制出特异、敏感、快速、简便的氯霉素药物残留快速检测试纸条。

本发明的技术方案:

一种氯霉素药物残留快速检测试纸条，底层为支撑层，中间层吸附层固定在支撑层上，外层保护膜固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为纤维层，吸附金标抗体纤维层，纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜层上有用偶联氯霉素药物的载体蛋白溶液印制的直线式检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠igg溶液印制的直线式对照印迹，检测印迹和对照印迹平行组合排列为“ⅱ”。支撑层是用不吸水的硬质塑胶片条或硬纸条制成。测试端纤维层用玻璃棉、或尼龙膜、或聚偏二氟乙烯（pvdf）膜、或聚酚膜制成，优选玻璃棉。吸水材料层用吸水纸制成。纤维素膜层用硝酸纤维素膜、或纯纤维素膜，或梭化纤维素膜制成。金标抗体纤维层用吸附氯霉素药物的金标抗体玻璃棉，氯霉素药物金标抗体为胶体金标记氯霉素药物的单克隆抗体或多克隆抗体，偶联氯霉素药物的载体蛋白溶液为氯霉素药物与载体蛋白偶联的复合溶液。在测试端吸附纤维层、金标抗体纤维层及吸水材料层上覆盖有保护膜，在测试端纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上印制有样品标记线，该标记线偏向测试端纤维层一侧约0.5cm处。偶联氯霉素药物的载体蛋白为牛血清白蛋白（bsa），或为鸡卵清白蛋白（ova），或为铁蛋白，或为血蓝蛋白。

本发明的氯霉素药物残留快速检测试纸条具有以下优点:

(1)特异性强，敏感性高。该试纸条以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标对单克隆抗体特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此，快速检测试纸条具有较高的特异性和敏感性。

(2)操作简便、快速。使用本发明试纸条时无需任何其它试剂，只需滴加100μl左右待检样品于样品垫上，在5分钟内即可判定检测结果。

(3)结果显示形象、直观、准确。本测试纸条以显示红棕色“i”及“ⅱ”印迹作为检测的阳性和阴性标记，即在纤维素膜上显示一条棕红色“l”印迹表示在被检测样品液中含有氯霉素，两条棕红色“ⅱ”印迹表示在被检样品中不含氯霉素，结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阴性和假阳性误判。

(4)成本低，投资少。使用快速检测试纸条，不需另配仪器设备及其它试剂，随时随地进行检测，费用低廉，可节省大量贵重仪器及设备费用。

(5)应用范围广，便于推广应用。本发明快速检测试纸操作简单，能满足不同层次人员的需要，包括专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、畜产品加工、集约化养殖到个体养殖等，具有广阔的市场前景和较好的经济、社会效益。

附图说明

图1为氯霉素药物残留快速检测试纸条结构示意图（其中1、样品吸收垫；2、结合物释放垫；3、反应膜；4、吸水垫；5、检测线；6.质控线；7、底板）。

图2为氯霉素药物残留快速检测试纸条俯视结构示意图（其中8-1和8-2是覆盖在试纸卡两端的保护膜，9为标记线）。

图3为氯霉素药物快速检测试纸卡阴性（图3.a）、阳性（图3.b），无效（图3.c）显色示意图，其中t质控区，c为检测区。

具体实施方式

制备氯霉素药物残留快速检测试纸条，首先需制备偶联氯霉素药物的载体蛋白和金标抗体，从而制备检测印迹和金标抗体纤维;其次需制备羊抗或兔抗小鼠igg抗体，用于制备对照印迹。

1.氯霉素药物与载体蛋白的偶联

分别采用混合酸酐法和碳化二亚胺法将氯霉素药物和卵清蛋白和血蓝蛋白偶联得到包被原（用于固定在反应膜上）和免疫原（用于制备单克隆抗体）。

(1)包被原的制备：

①将5mg氯霉素药物0.5ml甲酰胺（dmf）溶解，冷却至10℃,加入氯甲酸异丁酯5μ1,4℃搅拌反应30min，即可得到反应液ⅰ液;

②称取卵清蛋白（ova）30mg，使之充分溶解在2ml50mm碳酸钠溶液中，即可得到反应液ⅱ液;其中氯霉素药物半抗原与所述卵清蛋白的摩尔配比为（15-20）:1。

③将反应ⅰ液逐滴缓慢滴加到该反应ⅱ溶液中，4℃反应4h，4℃过夜。取最终反应物于ph7.4，0.02m磷酸盐缓冲液中透析纯化24h，3000g以上离心30min，收集上清液，即得到包被原。

(2)免疫原的制备：

①将5mg氯霉素药物、10mgn-羟基琥珀酰亚胺（nhs），以及12.5mg碳化二亚胺（edc）充分溶解于1mldmf中，于室温下搅拌24h，即可得到反应液ⅰ液;

②称取血蓝蛋白40mg，使之充分溶解在3ml40mm碳酸钠溶液中，即得到反应液ⅱ液，其中氯霉素药物半抗原与所述血蓝蛋白的摩尔配比为（12-15）:1。

③将反应液ⅰ液逐滴缓慢滴加到反应液ⅱ液中，并于室温下搅拌3h，然后4℃过夜，过柱，用缓冲液平衡和洗脱，进一步纯化后得到免疫原。

2.抗氯霉素药物单克隆抗体的制备

(1)动物免疫：将免疫原注入到balb/c小鼠体内，免疫剂量为100μg/只，使其产生抗血清。

(2)细胞融合和克隆化：小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按7：1比例(数量配比)与sp2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争elisa测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

(3)细胞冻存和复苏：将前述单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1x10⁶个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

(4)单克隆抗体的生产与纯化：将balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射氯霉素药物的单克隆杂交瘤细胞株5x10⁷个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，得到单克隆抗体，于-20℃保存。

3.氯霉素药物金标抗体和金标抗体玻璃棉的制备

以柠檬酸钠还原法制备金溶胶，即在50~100ml沸腾的0.01~0.05%氯金酸水溶液中加入2~4ml的0.5~2%柠檬酸三钠溶液，获得直径15nm左右的胶体金。以0.1mol/l的k2c03调胶体金ph至8.5~9.5，置于以1:2000~3000的标记比将待标记的氯霉素药物单克隆抗体加入ph8.5~9.5的金溶胶中，标记10min后，加20%peg10000至终浓度0.05%，4℃、1500~3000rpm离心20min，除去未结合的胶体金颗粒，4℃,15000rpm离心1h，弃上清，获初步纯化金标抗体蛋白混合物后，用丙烯葡聚糖s-400柱层析，分离纯化金标蛋白，获氯霉素药物的胶体金标记抗体。将1:(100~500)稀释的胶金标记抗体吸附于精制玻璃棉中，4℃低温真空干燥，制备氯霉素药物金标抗体玻璃棉。

4.羊抗或兔抗小鼠igg的制备

以饱和硫酸铵提取小鼠血清igg，取1份小鼠血清加2份pbs(ph7.2)混匀，加等体积饱和硫酸铵混匀，置4℃冰箱2h,4℃,1200r/min离心15min，弃上清;以适量pbs(ph7.2)溶解沉淀，加饱和硫酸铵至终浓度33%，置4℃冰箱2h,4℃,1200r/min离心15min，弃上清，以少量pbs印h7.2)溶解沉淀，置4℃冰箱内用pbs(ph7.2)过夜透析，换液2~3次，4℃,12000r/min离心15min，收集上清，以紫外分光光度计测定其蛋白浓度，以50~100μg/kg体重(小鼠血清igg)经皮下和肌肉注射免疫健康羊或家兔3~4次，末次免疫10天后，静脉采血，以elisa测定其血清抗体效价在1:2000以上，心脏采血或颈动脉放血，收集其高免血清，以饱和硫酸铵提取羊抗或兔抗小鼠igg(方法与提取小鼠血清igg相同，不重述)，用于氯霉素药物快速检测试纸条对照显示印迹的制备。

5.氯霉素药物快速检测试纸条反应原理

(1)当待检样品溶液滴入试纸条加样孔后，样品溶液因硝酸纤维素膜载体的毛细管作用向另一端扩散。在移动的过程中，会发生相应的抗原抗体反应，并通过免疫胶体金的颜色显示出来。如果样品溶液含有氯霉素药物残留，氯霉素药物先和胶体金颗粒上的抗体反应，因此当胶体金颗粒随样品溶液扩散至检测线时，胶体金颗粒上抗体的活性位点因被样品溶液中的氯霉素药物占据而无法与检测线上氯霉素药物抗原结合，不能显示检测印迹，而羊抗鼠igg抗体则可与金标抗体结合，质控区显色，形成一条红色对照印迹“ⅰ”，呈一条印迹为阳性；相反样本溶液中无氯霉素药物则不能阻止金标抗体与纤维素膜上氯霉素药物抗原偶联载体蛋白检测印迹结合，检测区显示红色印迹“ⅰ”，同样羊抗鼠igg抗体也与金标抗体结合，质控区也显示红色对照印迹“ⅰ”，形成两条红线“ⅱ”阴性标记，如果纤维素膜上没有红色标记显示，则试纸卡无效。

(2)氯霉素药物残留快速检测试纸条的结构，参见图1、图2。图中1为样品吸收垫，用玻璃棉制成，2为结合物释放垫层，根据上述具体实施方式4中所述的制备方法，制备吸附有氯霉素药物单克隆抗体的金标抗体纤维层，3为反应膜层，采用硝酸纤维素膜，4为吸水材料层，用吸水滤纸制成，将编号1，2，3，4各层从左至右依次粘贴固定在塑胶条7上，各层交界处纤维互相交叉渗透。5为用偶联氯霉素药物的卵清蛋白（ova）溶液印上检测印迹“ⅰ”，6为用羊抗小鼠igg溶液印上对照印迹“ⅰ”，两印迹平行排列形成组合印迹带“ⅱ”。8-1为覆盖在样品吸收垫层1和金标抗体纤维层2上面的测试样品端白色保护膜，在1和2交界处对应保护膜8-1位置上偏向于样品吸收垫一侧0.5cm处印有标记线9，9的右端印有箭头及max字样，滤纸层4为吸水层（手柄端）上覆盖有其它颜色（如黄色）保护膜8-2。

7.检测样品液的制备：

(1)取2g动物组织匀浆物于50ml聚苯乙烯离心管中；

(2)加入8ml甲醇-1%三氯乙酸溶液，充分混匀，室温以3000g以上的速度离心5min；

(3)取1ml上层液体加入9ml磷酸盐缓冲液中，充分混匀后用1m的氢氧化钠溶液调ph值至中性，混匀，室温以3000g以上的速度离心离心5min；

(4)取上层液待测。

8.检测操作方法:从包装袋中取出试纸条，用滴管吸取待检溶液，在加样孔中滴入3滴(约100μl),加样后开始计时，结果应在3-5分钟读取，其他时间判读无效。

9.检测结果判断:如果在纤维素膜上有一条红棕色标记“ⅰ”显示，检侧结果呈阳性，表示在被检测样品液中含氯霉素药物（如图3b所示），如果氯霉素药物快速检测试纸条上的纤维素膜上出现两条红棕色标记“ⅱ”，检测结果呈阴性，表示待检样品中不含氯霉素药物成份（如图3a所示），如未出现c线，可能操作不当或试剂板已失效（如图3.c所示）。