一种甜叶菊糖液的提取方法与流程

一种甜叶菊糖液的提取方法，涉及植物体内各化学组分分离、提取和检测技术领域，更具体的说是一种利用层析柱分离提取甜叶菊糖液的方法。

背景技术：

甜叶菊是菊科多年生草本植物，原产南美巴拉圭，现世界各地引种栽培均获得成功。甜叶菊叶片中含有的甜菊糖甙甜度是蔗糖的250-300倍，但所含热量仅是蔗糖的1/300，是目前已知最甜的天然甜味剂，已经替代糖精在食品、医药等工业中得到广泛应用，并对肥胖症、低血糖、糖尿病、小儿龋齿、高血压、心脏病等具有一定的防治效果和辅助治疗作用，是继甘蔗糖、甜菜糖之外有开发价值和健康推崇的天然蔗糖替代品，被国际上誉为“世界第三健康糖源”。

甜叶菊叶片中含有的甜味成分主要有十种，分别为甜叶菊糖苷(stv)，甜叶菊醇双糖苷(stb)，莱鲍迪苷a，b，c，d，f，m(ra，rb，rc，rd，rf，rm),杜尔可苷a(da)和甜茶苷（rub）。其中，stv和ra所占比例最大，一般为90%。不同甜菊糖苷的口感和甜度都各不相同，ra的甜度高于甜菊苷stv且口味优于stv，因此将ra的含量及所占比例作为甜叶菊品种和甜菊糖苷质量评价的主要指标。

甜叶菊糖苷测定一般采用高效液相色谱法，操作简单，准确率高，但对甜叶菊糖提取液纯度要求较高。若提取液中含有较多杂质，测定操作时基线较难跑平稳，色谱图中也较难准确识别各个糖苷峰图，尤其是rm和rd出峰时间较早，极易同一些杂质峰混淆在一起。常规的离心和超声波提取糖液的方法虽然简单省时，但提取的糖液中杂质较多，影响测定的准确性。

本发明采用树脂层析柱法提取甜叶菊糖液，向浸提液中加入冰乙酸调ph值为4.5~5.0，较好地减少甜叶菊叶片中的色素析出；同时糖液过滤后分别用0.5%氢氧化钠和0.5%盐酸除去溶于酸碱的杂质，提高糖液的纯度，为准确计算各组分糖苷含量奠定了基础。

技术实现要素：

本发明的目的在于尽可能减少或抑制甜叶菊叶片浸提过程中色素的析出，除去糖液中可溶于酸、碱的杂质，提高检测糖液的纯度，以便快速准确识别高效液相检测色谱图中各糖苷峰图，准确计算出各糖苷含量。

本发明是这样实现的：

一种甜叶菊糖液的提取方法，其特征是，它包括以下技术环节：

①浸提：称取甜叶菊叶片粉末2.0~2.5克装入无纺布袋中，将布袋放入150毫升烧杯中，加入100毫升65℃蒸馏水浸提，用冰乙酸将蒸馏水ph值调为4.5~5.0，水浴保温，60分钟后倒出浸提液，重复浸提3~4次；

②过滤：将全部浸提液倒入层析柱中进行吸附过滤，滴速为1滴/3秒；

③酸碱洗涤：先后向层析柱中加入180~300毫升0.5%盐酸和180~300毫升0.5%氢氧化钠进行洗涤，酸、碱洗涤后分别用蒸馏水冲洗到滴液ph值为7，酸、碱冲洗时滴速为1滴/秒，蒸馏水冲洗不限流速，自然下流；

④糖液解离：向层析柱中加入250毫升70%的酒精解离树脂吸附的糖，层析柱下端用烧杯接取糖液，滴速为1滴/3秒；

⑤检测：糖液用孔径为0.45微米的针头过滤器过滤后用高效液相色谱进行糖甙含量测定。

本发明的有益效果：

本发明通过向甜叶菊浸提液中加入冰乙酸调ph值为4.5~5.0，有效减少和抑制甜叶菊叶片中色素的析出，同时用层析柱过滤糖液后分别用0.5%氢氧化钠和0.5%盐酸除去糖液中可溶于酸碱的杂质，较好地提高糖液的纯度，解决了高效液相色谱法测定各组分糖苷含量时，由于糖液中含有较多杂质，测定图谱基线较难跑平稳，色谱图较难准确识别各糖苷峰图的问题，同时也为准确计算各组分糖苷含量奠定了基础。

附图说明

图1是各糖苷标样定位图；

图2是离心法提取甜叶菊b1糖液的高效液相色谱图；

图3是未加冰乙酸浸提的树脂层析柱法提取甜叶菊b1糖液的高效液相色谱图；

图4是加冰乙酸浸提的树脂层析柱法提取甜叶菊b1糖液的高效液相色谱图。

具体实施方式：

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

甜叶菊b1糖液的提取方法：

①浸提：称取甜叶菊叶片粉末2.2克装入无纺布袋中，将布袋放入150毫升烧杯中，加入100毫升65℃蒸馏水浸提，用冰乙酸将蒸馏水ph值调为4.6，水浴保温，60分钟后倒出浸提液，重复浸泡3次；

②过滤：将全部浸提液倒入层析柱中进行吸附过滤，滴速为1滴/3秒；

③酸碱洗涤：先后向层析柱中加入250毫升0.5%盐酸和250毫升0.5%氢氧化钠进行冲洗，酸、碱冲洗过后分别用蒸馏水冲洗到滴液ph值为7，酸、碱冲洗时滴速为1滴/秒，蒸馏水冲洗不限流速，自然下流；

④糖液解离：向层析柱中加入250毫升70%的酒精来解离树脂吸附的糖，层析柱下端用烧杯接取糖液，滴速为1滴/3秒；

⑤检测：糖液用孔径为0.45微米的针头过滤器过滤后用高效液相色谱进行糖甙含量测定。

试验结果见说明书附图4。

说明书附图1是各糖苷标样的高效液相色谱图，主要根据各糖苷出峰时间来判定样品中各糖苷峰图。由图1可知，各糖苷出峰时间：rm为4.62min;rd为5.406min;ra为13.096min;stv为13.729min;rc为19.918min;rb为44.028min;stb为45.843min。糖苷rf、da和rub没有标样，可根据已知各糖苷的出峰先后顺序判定具体峰图，出峰顺序为rm、rd、ra、stv、rf、rc、da、rub、rb、stb。样品中各糖苷的出峰时间和标样有时不完全吻合，但先后不会相差很多。

说明书附图2相比标样图1由于5min前后的杂质峰太多，无法判定糖苷rm和rd的具体峰图；（样品中含糖苷rm和rd的含量都比较少，不可能有高峰出现，所以5min前后的高峰为杂质峰或糖苷rm、rd峰和杂质峰的重叠峰。）糖苷da和rub的峰图因部分杂质导致不够对称。

说明书附图3相比标样图1能够识别出糖苷rd峰图，较难判定糖苷rm峰图，其余各糖苷峰图也比较对称。

说明书附图4由于在浸提的过程中加入了冰乙酸，抑制和减少了甜叶菊色素的析出，相比标样图1能较清楚识别出糖苷rm和rd的峰图，其余各糖苷峰图也比较对称。

综上可知，采用本发明方法提取的糖液纯度较高，高效液相色谱图较清晰识别各糖苷峰图。

技术特征：

技术总结
本发明公布了一种甜叶菊糖液的提取方法，其做法是将甜叶菊叶片粉碎后放入蒸馏水中浸提，将浸提液倒入层析柱中过滤，然后用酸、碱洗去可溶性杂质，最后用70%的酒精解离出糖液。利用这种方法可有效减少甜叶菊叶中色素析出，提高糖液的纯度，快速准确地识别高效液相色谱检测图中各糖苷峰图，为准确计算出各糖苷含量奠定基础。

技术研发人员：何克勤;李刘东;崔广荣;金婷;童飞
受保护的技术使用者：安徽科技学院
技术研发日：2018.07.20
技术公布日：2018.12.25