利用自花授粉及异花授粉的苹果花柱筛选差异蛋白的方法与流程

本发明属于分子生物学和基因工程领域，涉及1个在苹果自交不亲和反应中发挥重要作用的钙调蛋白结合转录因子。具体为一种通过将非标定量技术、高效液相色谱分级技术以及基于质谱的定量蛋白质组学技术相结合，对自花及异花授粉花柱进行定量蛋白质组研究的方法。

背景技术：

植物的自交不亲和性反应是一种花柱与花粉间的特异性识别反应，以苹果为代表的蔷薇科果树自交不亲和产生的机制是植物识别自我花粉，造成花粉管在花柱中难以生长至胚珠，不能完成双受精作用。目前，对于苹果自交不亲和机理的研究主要集中于花柱特异表达的s-rnase蛋白作为花柱决定因子，授粉后由花柱细胞特异产生，并在abcf转运蛋白的协助下非特异性进入花粉管内，自我s-rnase作为“细胞毒素”分解花粉管内rrna，使花粉管停止生长，最终导致花粉管在花柱生长过程中死亡，无法到达子房完成双受精作用；但随着对自交不亲和现象研究的不断深入，相继发现了众多的调控因子可能参与花粉管在花柱中的生长过程，然而目前尚未有蛋白激酶的相关报道。

钙调蛋白结合转录因子可参与众多信号系统，包括乙烯，生物胁迫，冷胁迫等信号系统，迄今为止，尚未有钙调蛋白结合转录因子参与苹果自交不亲和反应和参与调控苹果花粉管生长的相关报道。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供了一种筛选苹果花柱自花授粉及异花授粉差异表达的钙调蛋白结合转录因子的方法，并利用生物信息学分析方法对所得的钙调蛋白结合转录因子进行分析，明确其作为一种调节因子参与苹果自交不亲和反应过程。本发明首先对苹果自花授粉花柱及异花授粉花柱进行非标定量、高效液相色谱分级以及基于质谱的定量蛋白质组学联合分析，筛选出自花授粉过程中显著上调的钙调蛋白结合转录因子，对所获得的钙调蛋白结合转录因子进行生物信息学分析，从而确定钙调蛋白结合转录因子参与苹果自交不亲和反应。

一种筛选苹果花柱自花授粉及异花授粉差异表达的钙调蛋白结合转录因子的方法，包括以下步骤：

步骤1、利用非标定量技术、高效液相色谱分级技术以及基于质谱的定量蛋白质组学技术联合分析，对苹果自花授粉花柱及异花授粉花柱进行定量蛋白组的研究，在所获得的差异表达蛋白中筛选到1个钙调蛋白结合转录因子，分析钙调蛋白结合转录因子在苹果自花授粉及异花授粉的差异倍数；

步骤2、对苹果自花授粉过程中获得的钙调蛋白结合转录因子进行生物信息学分析，从而确定钙调蛋白结合转录因子(如序列表序列1所示)参与苹果自交不亲和反应。

在上述方案的基础上，所述钙调蛋白结合转录因子定位在细胞质中。

在上述方案的基础上，所述钙调蛋白结合转录因子的氨基酸序列含有保守的tig转录结构域和钙离子结合结构域。

在上述方案的基础上，钙调蛋白结合转录因子在苹果自花授粉及异花授粉的差异倍数均在1-1.5倍之间。

附图说明

本发明有如下附图：

图1苹果自花及异花授粉花柱中显著上调的钙调蛋白结合转录因子差异倍数分析图。

图2.苹果自花授粉花柱中上调的钙调蛋白结合转录因子蛋白质保守结构域分析图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步详细说明。

具体实验步骤如下：

一、苹果花柱自花及异花授粉

以苹果‘金冠’为木本，分别收集‘金冠’花粉和‘富士’花粉

1、以苹果‘金冠’为木本

在‘金冠’花开至大花苞期，用镊子去除花药，并套袋。

2、收集‘金冠’花粉和‘富士’花粉

分别在初花期收集‘金冠’、‘富士’花朵，剥离花药后荫干散粉2-3d，待花粉散开后加入干燥剂(变色硅胶)待用。

3、自花授粉为‘金冠’花粉授‘金冠’花柱，异花授粉为‘富士’花粉授‘金冠’花柱，授粉后及时套袋，防止其他花粉污染。

4、分别切取授粉后12h的花柱，进行液氮速冻，用于蛋白质组定量测序。

二、苹果自花授粉花柱及异花授粉花柱差异蛋白分析

1、利用非标定量技术、高效液相色谱分级技术以及基于质谱的定量蛋白质组学技术联合分析，对自花授粉花柱及异花授粉花柱进行定量蛋白组的研究。在所获得的差异表达蛋白中筛选到1个钙调蛋白结合转录因子，分析该蛋白在自花授粉/异花授粉的差异倍数，结果如图1所示。

三、钙调蛋白结合转录因子功能分析

苹果自花授粉花柱中显著上调的钙调蛋白结合转录因子进行亚细胞结构预测及其所参与的生物学过程、细胞学组分以及分子功能预测，如表1所示。

表1

四、钙调蛋白结合转录因子结构分析

利用ncbi数据库，明确所获得的差异蛋白为钙调蛋白结合转录因子家族成员。确定在苹果自花及异花授粉过程中有钙调蛋白结合转录因子的参与。

五、试验结果

1.苹果自花及异花授粉花柱中显著上调的钙调蛋白结合转录因子差异倍数分析，如图1所示。

2.通过对自花授粉花柱中上调的钙调蛋白结合转录因子进行蛋白质保守结构域分析，明确钙调蛋白结合转录因子参与苹果自交不亲和反应，如图2所示。

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

技术特征：

技术总结
本发明属于分子生物学和基因功能领域，涉及一种利用自花授粉及异花授粉的苹果花柱筛选差异蛋白的方法，涉及1个在苹果花柱自花授粉及异花授粉过程中差异表达的钙调蛋白结合转录因子。本发明公开了利用自花授粉及异花授粉的苹果花柱筛选差异蛋白的方法，自花授粉及异花授粉的苹果花柱所筛选的钙调蛋白结合转录因子差异倍数均在1‑1.5倍之间，明确了在苹果自花授粉过程中有钙调蛋白结合转录因子的参与。

技术研发人员：李天忠;顾钊宇;李威;杨清;李洋;于杰;刘春生
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：2018.09.28
技术公布日：2019.03.15