本发明涉及临床体外诊断试剂技术领域，特别涉及一种定量测定肌酐浓度的干化学试剂片及其制备方法。
背景技术：
肌酐是肌肉在人体内代谢的产物，主要由肾小球滤过排出体外。每20g肌肉代谢可产生1mg肌酐，在肉类食物摄入量稳定时，身体的肌肉代谢又没有大的变化，肌酐的生成就会比较恒定。肌酐是一种低分子量含氮化合物，分子量116d。人体90％的肌酸存在于肌肉中，而且大部分以磷酸肌酸的形式存在。磷酸肌酸脱去磷酸后生成肌酐，后者随尿液排出即为尿肌酐。肌酐可以顺利通过肾小球滤过。在原尿中肾小管基本上不重吸收，近曲小管尚能分泌尤其当血浆肌酐浓度升高时，肾小管对肌酐的分泌作用明显增强。
血中肌酐来自外源性和内源性两种，外源性肌酐是肉类食物在体内代谢后的产物；内源性肌酐是体内肌肉组织代谢的产物。肌酐主要由肌肉产生，血中肌酐主要由肾脏从尿中排泄。血清肌酐来自肌肉组织，其浓度与肌肉量成比例，故肢端肥大症、巨人症时，血清肌酐浓度增高；相反肌肉萎缩性疾病时血清肌酐浓度可降低。透析治疗前后，血清肌酐测定可用于选择透析指征，判断透析治疗效果。血中肌酐浓度主要与肾小球滤过率相关，因而血清肌酐及尿液肌酐排泄量测定是临床常规肾功能试验之一。血清肌酐浓度与肾小球滤过率(gfr)相关，从血清肌酐浓度，加上体重、性别和年龄等因素可推算肌酐清除率，以代表gfr。凡gfr下降的疾病，如急性肾小球肾炎、慢性肾小球肾炎(失代偿期)、急性或慢性肾功能不全等时均有血清肌酐浓度升高。因此血浆肌酐浓度及尿液肌酐排泄量是肾小球滤过功能的有用指标。
目前测定肌酐的方法按试剂类型可分为液体试剂和干化学试剂两种方法。液体试剂的检测方法主要有分光光度法、旋光度法、气相色谱法、高效液相色谱法等。这些方法对肌酐浓度进行检测需要特定的设备，设备本身较为昂贵，不具有经济性；同时需要专业技术人才操作仪器，不具有应有的普适性。方法测定周期长，分析过程较为复杂，无法实现肌酐的实时测定。
干化学试剂主要应用于急诊、现场检测。具有简便、快速、灵活以及无需专业人员操作等优点。目前国内基本为定性或半定量测定，这种干化学试剂片均是由滤纸、纤维素片、多孔胶膜等一类片层物质预先固定全部试剂，两层和三层经过堆叠、粘合、冲压等处理结合。测量线性范围不大，遇到有使用药物情况下会干扰实验结果。有许多分析测试中的试剂不能预先混合，而且复杂测试液需要预处理，这就限制了干化学试剂片应用领域。定量检测的干化学试剂卡都为国外生产。以强生公司和富士公司为代表的多层膜干片法，利用感光胶片的涂层技术将试剂层、辅助试剂层、光漫射层和分布层等试剂涂布在透明支持层上，从支持层的反面测定光密度的变化。上述干化学试剂片虽能定量检测，但分布层或扩散层需用到有机试剂，对材料设备要求高，生产工艺复杂，并且对制备人员健康危害极大，污染环境。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了一种定量测定肌酐浓度的干化学试剂片及其制备方法。该干化学试剂片检测结果准确性高，精密度好，稳定性好，保存期长，操作简便，适用范围广。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种定量测定肌酐浓度的干化学试剂片，包含四个叠层，依次为支持层、显色层、试剂层和扩散层；
试剂层中的试剂包括缓冲体系、亲水性胶体、肌酸脒基水解酶、肌氨酸氧化酶、过氧化物酶、保护剂、螯合剂、激活剂、表面活性剂；各组分用量为：
显色层中的试剂包括色原、肌酐胺基水解酶、亲水性胶体和表面活性剂。
检测原理为：液体样本滴加在试剂片扩散层，均匀分布并渗透至试剂层，样品中的内源性肌酸先被氧化，随后样本渗透至显色层，显色层中肌酐胺基水解酶将肌酐水解成肌酸。肌酸通过肌酸脒基水解酶转化为肌氨酸和尿素。肌氨酸在肌氨酸氧化酶存在下被氧化成甘氨酸、甲醛和过氧化氢。过氧化氢在过氧化物酶的催化作用下使显色层中的4-氨基安替比林和n-乙基-n-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠氧化为蓝色醌型化合物，在初始反应阶段，样品中的内源性肌酸被氧化。在2个时间点测量所产生的反射率的变化。反射率的差异与样品中存在的肌酐浓度成正比。在590nm波长下，经反射分光光度法测量反射率的变化，通过标准曲线计算肌酐的浓度。将反应温度控制在37℃±1℃条件下，测定在5分钟内即可完成。在扩散层滴加样本，在相反的一面测定，显色强度高，减少加样端测定产生的气泡、过量液体、浊度而造成的干扰。同时由于显色层为亲水胶体，具有很高的显色匀度。
上述结构的干化学试剂片主要用于测定血清、尿液、全血等样本，测定前将样本用合适的等渗液进行稀释，再进行测量。
作为优选，试剂层中，缓冲体系为tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、mops缓冲液或磷酸盐缓冲液，ph值在7.0～8.0。
优选地，缓冲体系的ph值在7.8～7.9。
作为优选，保护剂为蔗糖。
作为优选，螯合剂为edta。
作为优选，激活剂为亚铁氰化钾。
作为优选，表面活性剂为聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯80、胆酸钠、聚氧乙烯月桂醚、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、聚乙二醇对异辛基苯基醚中的一种或几种。
优选地，表面活性剂为聚氧乙烯月桂醚。
作为优选，试剂层中各组分用量为：
作为优选，亲水性胶体选自聚乙烯醇、支链淀粉、纤维素酯、琼脂糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、羟丙基甲基纤维素、甲基乙烯基醚/马来酸酐共聚物中的一种或多种。
优选地，亲水性胶体为羟丙基甲基纤维素与聚乙烯醇的混合物。
作为优选，显色层中色原由a和b组成，所述a为4-氨基安替比林，b选自苯酚、对氯酚、对羟基苯甲酸、n-乙基-n-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠、n-乙基-n-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠、3,5-二氯羟基苯磺酸钠中的一种或多种。
作为优选，显色层中各组分用量为：
优选地，显色层中色原由4-氨基安替比林和n-乙基-n-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠组成，显色层中表面活性剂为聚乙二醇对异辛基苯基醚，显色层中各组分用量为：
更优选地，显色层中各组分用量为：
作为优选，扩散层由缓冲体系、亲水性高分子聚合物、过氧化氢酶、表面活性剂、颗粒物质。
作为优选，扩散层中各组分用量为：
作为优选，扩散层中，缓冲体系为tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、mops缓冲液或磷酸盐缓冲液，ph值在7.0～8.0。
作为优选，亲水性高分子聚合物选自聚氨酯、聚酰胺、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇、支链淀粉、黄原胶、海藻酸钠、阿拉伯树胶、桃胶、壳聚糖、聚乙烯乙酸酯中的一种或多种；亲水性高分子聚合物具有多孔结构，可以过滤掉样本中的干扰物质。
优选地，亲水性高分子聚合物为聚氨酯。
作为优选，表面活性剂为聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯80、胆酸钠、聚氧乙烯月桂醚、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、聚乙二醇对异辛基苯基醚中的一种或几种；
优选地，表面活性剂为聚乙二醇对异辛基苯基醚。
作为优选，颗粒物质选自颜料、微晶胶体、二氧化硅、树脂珠、玻璃珠、硅藻土、纤维素酯中的一种或多种；
优选地，颗粒物质为二氧化硅和纤维素酯。
作为优选，支持层为聚对苯二甲酸乙二醇酯的聚合物，其厚度为50～300微米。
作为优选，支持层厚度为100～200微米。
作为优选，支持层的表面经过紫外照射、电晕或涂覆底层处理。
优选地，支持层经过紫外照射处理。
本发明还提供了该干化学试剂片的制备方法，包括如下步骤：
将显色液试剂、反应液试剂依次涂覆在支持层上，然后将扩散液试剂喷涂在支持层上，干燥，得到依次包括支持层、显色层、试剂层和扩散层的干化学试剂片；
试剂层中的试剂包括缓冲体系、亲水性胶体、肌酸脒基水解酶、肌氨酸氧化酶、过氧化物酶、保护剂、螯合剂、激活剂、表面活性剂；各组分用量为：
显色层中的试剂包括色原、肌酐胺基水解酶、亲水性胶体和表面活性剂。
作为优选，支持层的表面经过紫外照射、电晕或涂覆底层处理。
作为优选，显色层和试剂层的涂覆方法包含流平、挂流、滚粘、涂布等方式制备，作为优选，制备方式为涂布。
本发明提供了一种定量测定肌酐浓度的干化学试剂片及其制备方法。该干化学试剂片包含四个叠层，依次为支持层、显色层、试剂层和扩散层；试剂层中的试剂包括缓冲体系、亲水性胶体、肌酸脒基水解酶、肌氨酸氧化酶、过氧化物酶、保护剂、螯合剂、激活剂、表面活性剂；显色层中的试剂包括色原、肌酐胺基水解酶、亲水性胶体和表面活性剂；扩散层中的试剂包括缓冲体系、亲水性高分子聚合物、过氧化氢酶、表面活性剂、颗粒物质。与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)操作过程简单，试剂无需配制，直接滴加样本检测。
(2)试剂层干燥无水分，试剂片稳定性良好。
(3)扩散层具有过滤功能，溶血、胆红素和抗坏血酸样本对测定结果没有明显干扰。
(4)检测结果重复性好、准确性高，可进行定量检测，线性范围宽。
(5)制备过程简便，易操作，危害性、污染性小。
实验表明，本发明所述定量测定人体血液肌酐浓度的干化学试剂片，检测结果准确性高，精密度好，特异性好，稳定性好，保存期长，操作简便，适用范围广，无需专业人员等优点很好的补充了湿化学法的不足之处，其测定准确度和精密度已经接近湿化学测定方法，在临床快速检测领域提供了极大的便利。
具体实施方式
本发明公开了一种定量测定肌酐浓度的干化学试剂片及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的定量测定肌酐浓度的干化学试剂片及其制备方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：本发明所述肌酐干化学试剂片的制备方法
透明支持层材料采用聚对苯二甲酸乙二醇酯材质，厚度为0.150mm，长度为10cm，宽度为10cm。表面经过紫外照射处理，照射距离5cm，照射时间60分钟。
显色液试剂的配方如下：
反应液试剂的配方如下：
显色层涂覆在经过紫外处理的聚对苯二甲酸乙二醇酯支持层上，试剂层经连续涂覆在显色层上，放入烘干箱中，30℃烘干20分钟。
扩散液试剂的配方如下：
将扩散液均匀的喷涂在试剂层上，放入烘干箱中烘干。用裁条机将其切割成10mm×10mm大小的试纸片，用铝箔袋密封保存。
检测方法：将6μl测试样本滴加于试剂片，37℃恒温条件下孵育5min，在3min与5min两个时间点用反射式光度计进行测定，计算反射率差值，根据标准曲线计算样品中肌酐的浓度。
实施例2：本发明所述方法的准确度分析
检测样品：20名体检者血样；
对比检测方法：用市售肌酐检测试剂盒(肌氨酸氧化酶法)3:1液体试剂在日立7080全自动生化分析仪上检测，由全自动生化分析仪加入4μl样本，试剂一180μl，试剂二60μl，37℃反应10min，在5min与10min两个时间点测定546nm的吸光度值，计算吸光度差值，根据标准曲线计算样品中肌酐的浓度。
用实施例1检测方法和对比检测方法分别测定20例样品，检测结果见表1。
表1分析结果
结果显示，根据检测结果计算出的r2值为0.9969，大于0.95，表明本发明所述方法检测结果与对比试剂盒检测结果无明显差异，具有较高准确度(符合度)。
实施例3：本发明所述方法的精密度分析
检测样品：任意一血清样品；
用实施例1检测方法对同一待测样品重复检测10次，检测结果见表2。
表2检测样品肌酐浓度(10次)及标准差率(变异系数)
结果显示，标准差率为1.21％，小于标准要求的10％，表明本发明所述方法具有高精密度。
实施例4：本发明所述方法的线性分析
检测样品：高浓度肌酐样品(3000μmol/l)；
将肌酐样品稀释成6个不同的浓度，依次为0μmol/l、375μmol/l、750μmol/l、1500μmol/l、2250μmol/l、3000μmol/l，采用实施例1的检测方法对上述样品的每个浓度进行2次检测，计算相关系数r值，检测结果见表3。
表3线性试验结果
结果显示，根据实施例1检测方法得到的检测结果计算出的r值为0.9999，接近于1，表明本发明所述方法在0μmol/l-3000μmol/l的范围内具有良好的线性度。
实施例5：本发明所述肌酐干化学试剂片的制备方法
透明支持层材料采用对苯二甲酸乙二醇酯材质，厚度为0.188mm，长度为20cm，宽度为20cm。表面经过电晕处理，电晕强度1000w，电晕时间20秒。
显色液试剂的配方如下：
反应液试剂的配方如下：
显色层涂覆在经过紫外处理的聚对苯二甲酸乙二醇酯支持层上，试剂层经连续涂覆在显色层上，放入烘干箱中烘干。
扩散液试剂的配方如下：
将扩散液均匀的喷涂在试剂层上，放入烘干箱中烘干。用裁条机将其切割成8mm×8mm大小的试纸片，用铝箔袋密封保存。
检测方法：将6μl测试样本滴加于试剂片，37℃恒温条件下孵育5min，在3min与5min两个时间点用反射式光度计进行测定，计算反射率差值，根据标准曲线计算样品中肌酐的浓度。
实施例6：本发明所述方法的稳定性分析
储存条件：密封放置在2-8℃冰箱中。
检验周期：2-8℃0时、3月、9月、15月、18月。
用实施例5的检测方法在上述检验周期时进行检测，计算准确度，精密度，线性范围，检测结果见表4。
表4稳定性试验结果
结果显示，根据实施例5检测方法得到的检测结果计算出的r2值均大于0.95，标准差率均小于标准要求的10％，r值均接近于1，表明本发明所述方法在2-8℃条件下储存18个月，试剂片仍具有良好的准确度，精密度，线性范围。
实施例7：本发明所述方法的抗干扰分析
检测样品：对照样本血清，对照样本血清中加入胆红素(20mg/dl)，对照样本血清中加入抗坏血酸(3mg/dl)；
采用实施例5的检测方法对上述样品进行3次检测，计算实验样本相对于对照样本测量结果所产生偏倚，检测结果见表5。
表5抗干扰试验结果
结果显示，根据实施例5检测方法得到的检测结果计算出的dobs均小于dc，未观察到临床显著性影响，表明本发明所述方法在20mg/dl浓度的胆红素和3mg/dl浓度的抗坏血酸对测定结果没有明显干扰。
对比例1：其他方法所述肌酐干化学试剂片的制备方法
透明支持层材料采用聚对苯二甲酸乙二醇酯材质，厚度为0.20mm，显色层和反应层采用滤纸材料，扩散层采用聚酯网布。将显色层、反应层和扩散层分别浸泡在显色液、反应液和扩散液中，完全浸湿后取出，刮平。放入40℃的干燥箱中，干燥后取出，将显色层粘贴于支持层上，再依次压实反应层和扩散层。
显色液试剂的配方如下：
肌酐胺基水解酶6000ku/l；
4-氨基安替比林1.3mmol/l；
n-乙基-n-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠5.0mmol/l；
反应液试剂的配方如下：
扩散液试剂的配方如下：
mops缓冲液0.200mol/l(ph值7.8)；
过氧化氢酶100ku/l；
聚乙二醇对异辛基苯基醚2.0g/l；
用裁条机将其切割成7mm×7mm大小的试纸片，用铝箔袋密封保存。
检测方法：将10μl测试样本滴加于试剂片，37℃恒温条件下孵育5min，在3min与5min两个时间点用反射式光度计进行测定，计算反射率差值，根据标准曲线计算样品中肌酐的浓度。
对比例2对比例1方法所述方法的精密度分析
检测样品：任意一血清样品；
用对比例1检测方法对同一待测样品重复检测10次，检测结果见表6。
表6检测样品肌酐浓度(10次)及标准差率(变异系数)
结果显示，标准差率为4.96％，明显大于实施例1标准差率1.21％，表明本发明所述方法具有高精密度。
对比例3对比例1方法所述方法的线性分析
检测样品：高浓度肌酐样品(3000μmol/l)；
将肌酐样品稀释成6个不同的浓度，依次为0μmol/l、375μmol/l、750μmol/l、1500μmol/l、2250μmol/l、3000μmol/l，采用对比例1的检测方法对上述样品的每个浓度进行2次检测，计算相关系数r值，检测结果见表7。
表7线性试验结果
结果显示，根据对比例1检测方法得到的检测结果计算出的r值为0.9968，而实施例1的r值0.9999更接近于1，表明本发明所述方法在0μmol/l-3000μmol/l的范围内具有良好的线性度。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。