一种快速检测生物组织切片COSMC基因突变试剂盒的制作方法

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种快速检测生物组织切片cosmc基因突变试剂盒，cosmc是t-合酶(t-synthase)的分子伴侣，t-合酶又叫半乳糖基转移酶(core1β3-galactosyltransferase)，cosmc基因突变意味着t-合酶活性的丧失，诱发肿瘤的发生和转移。

背景技术：

t-合酶是合成核心1(core1)结构的唯一糖基转移酶，在分子伴侣cosmc的协助下，将半乳糖(galactose)添加到cd175抗原(galnacα1-ser/thr)糖链上形成cd176抗原。用示意图可以简单表述为：cd175+udp-galactoset-合酶(cosmc)cd176抗原。在人体和其他脊椎动物中，t-合酶失活将导致机体细胞内堆积大量的cd175抗原，但是仅有肿瘤糖蛋白cd175抗原的过量表达，并不代表cosmc基因突变及t-合酶活性丧失，相反有时cd175表达增多时，往往伴有t-合酶活性异常升高。当只有cd175抗原过量表达而没有cd176抗原同时表达时，才能确认cosmc基因突变和t-合酶丧失活性。t-合酶的活性正常与否与癌症发生和转移密切相关。目前，已有一些检测新鲜组织细胞裂解液t-合酶活性的方法，原文的标题是anovelfluorescentassayfort-synthaseactivity，文献发表在2010年的《glycobiology》volume21(3)p352-362上，该方法只能用于新鲜的组织细胞样品，检测方法比较繁琐，且不能用于病理组织切片的快速检测。

技术实现要素：
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有鉴于此，本发明研制一种快速检测生物组织切片cosmc基因突变试剂盒。该试剂盒包括：1)1管标记荧光的抗cd175抗原的凝聚素haa(蜗牛凝集素，helixaspersa)。2)1管标记荧光的能与cd176抗原特异性结合的凝聚素pna(花生凝集素，peanutlectin)。3)1管细胞核荧光染色剂dapi。4)1瓶荧光凝聚素稀释液。5)1瓶tbs缓冲液。6)1瓶抗原修复液。7)1瓶封片剂。8)1塑料盒(五张)阳性对照病理切片、9)一份说明书和10)一份质检报告。本试剂盒用荧光凝集素双染色法，同时检测病理组织切片cd175和cd176抗原，haa阳性同时pna阴性的组织细胞即表明cosmc基因突变和t-合酶失活(见下图)；而pna阳性和haa与pna双阳性者则表明t-合酶活性依然存在，甚至t-合酶活性增高。

本发明的有益效果如下：本发明通过荧光凝聚素双染色法的检测方法，快速判定病变组织cosmc基因突变的存在与否，目前已证实在消化道组织中，发生cosmc基因突变的病变部位，其癌变率明显增高，例如结肠息肉伴有cosmc基因突变则癌变风险增大。因此，结肠镜检查时如发现息肉应作cosmc基因突变的快速检测，有利于对病人采取及时有效的治疗措施。

附图说明

图1标示1为棕色塑料管，用于凝聚素和细胞核荧光染料dapi。标示2为白色试剂瓶，凝聚素稀释液、tbs缓冲液和抗原修复液均用此瓶。标示3为棕色玻璃试剂瓶，用于封片剂。标示4为长方形无色塑料盒，内装病理切片。图2标示5为试剂盒内的纸质带下凹位的试剂架，标示10为试剂盒的硬质盒体。图3标示6安放棕色塑料试剂管，标示7安放白色塑料试剂瓶，标示8安放棕色玻璃试剂瓶。标示9安放病理切片无色塑料盒。

具体实施方式

通过下面给出的本发明的具体实施例可以进一步清楚的了解本发明，但它们不是对本发明的限定。

实施例1

荧光凝聚素双染色法操作比较简单，符合快速诊断的要求。

对于石蜡切片，首先需要脱蜡水化和抗原修复；此后，石蜡切片和冰冻切片方法步骤相同，故一同描述。

1、荧光凝集素染色：首先用免疫组化笔圈好待检组织切片，将haa和pna荧光凝集素原液按1：500的比例加入到凝集素稀释液中充分混匀，然后滴加凝集素混合液到载玻片上，4℃孵化20-30分钟。

2、细胞核染色：将载玻片从冰箱中取出，放入缓冲液tbs中洗3次，每次3-5分钟，擦干组织周围的pbs后加上细胞核蓝色荧光染料dapi，室温下5分钟。

3、封片观察：用缓冲液tbs洗3次，每次3-5分钟，然后滴加防荧光退色封片剂，覆上盖玻片，在荧光显微镜下进行观察。

技术特征：

技术总结
本发明及生物医学领域，具体涉及一种快速检测生物组织切片COSMC基因突变试剂盒。该试剂盒内含：1)荧光(红色)凝集素HAA浓缩液1管和2)荧光(绿色)凝集素PNA浓缩液1管、3)细胞核荧光染色剂DAPI1管。4)凝集素稀释液1瓶、5)TBS缓冲液1瓶、6)抗原修复液1瓶、7)封片剂1瓶、8)阳性对照病理切片1塑料盒(五张)、9)说明书和10)质检报告各一份。此外，试剂盒的盒体和盒内带下凹位的试剂架均为硬纸材料。本试剂盒通过荧光免疫凝集素直标双染色法，同时检测组织切片中CD175抗原和CD176抗原的表达情况，HAA阳性同时PNA阴性者，即表明COSMC基因突变和T‑合酶活性丧失。该产品能迅速确定生物组织切片COSMC基因突变和T‑合酶失活情况，对于研究T‑合酶生物学意义以及与人类疾病的关系都有重要的意义。

技术研发人员：丁晓昆
受保护的技术使用者：丁晓昆
技术研发日：2019.04.30
技术公布日：2019.08.23