6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备阿米卡星检测试剂中的用途的制作方法

本申请要求2019年1月9日提交的201910017764.4和2019年5月21日提交的201910423122.4《6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备检测试剂中的用途》的优先权，其通过引用并入此处。本申请涉及生物检测领域，特别是涉及一种突变的酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶(简称g6pdh)及其在阿米卡星检测试剂盒中的应用。
背景技术：
：半抗原，某些小分子物质(分子量小于4000da)，其单独不能诱导免疫应答，即不具备免疫原性，但当其与大分子蛋白质或非抗原性的多聚赖氨酸等载体交联或结合后可获得免疫原性，诱导免疫应答。这些小分子物质可与应答效应产物结合，具备抗原性，它只有免疫反应性，不具免疫原性，又称不完全抗原。半抗原能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应，又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗原。它只有免疫反应性，不具免疫原性，又称不完全抗原。大多数多糖、类脂、激素、小分子药物都属于半抗原。如果用化学方法把半抗原与某种蛋白分子(载体)结合，会获得新的免疫原性，并能刺激动物产生相应的抗体。半抗原一旦与蛋白结合，就构成该蛋白质的一个抗原簇。一些比一般半抗原分子量小，但有特异结构的化学活性基团物质(如青霉素、磺胺剂等)，称为简单半抗原。小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，多采用竞争模式。原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，显色愈浅。小分子激素、药物等elisa测定多用此法。阿米卡星(amikacin)结构式如下所示：阿米卡星是氨基糖甙类抗生素，用于治疗革兰阴性杆菌所致的尿路、下呼吸道、腹腔、软组织、骨和关节、生殖系统等部位的感染，以及败血症等。本品能引起不可逆性耳毒效应，肾毒性甚微，为可逆性，神经肌肉阻滞罕见。因此，应对该药不良反应监测予以重视。而且由于药物代谢个体存在差异，临床使用时应结合血药浓度监测，制定合理的给药方案，尽量避免不良反应发生。目前已知的阿米卡星检测方法主要有：高效液相色谱法(hplc)、化学发光免疫、酶联免疫吸附剂测定(elisa)、均相酶免疫测定法、胶乳凝集比浊法等方法。hplc法需要复杂的样品前处理，操作复杂周期长且成本昂贵；发光免疫法试剂成本昂贵，不适合常规治疗药物检测，更不利于大范围推广。现有的均相酶免疫测定法、胶乳凝集比浊法常常因制备工艺复杂、批间差大，应用受到一定限制。现有技术的方法依赖于对小分子药物(阿米卡星)自身所带反应基团进行的激活，之后再与酶进行反应。这样的偶联方法会出现同一葡萄糖六磷酸脱氢酶上链接有多个阿米卡星的情况，且偶联位点难以确保一致性，难以保证小分子药物和酶之间的定向1：1反应，而导致批间差异大。技术实现要素：鉴于本领域的需求，本申请提供了一种新型的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体、及其在制备阿米卡星检测试剂盒中的用途。根据一些实施方案，提供了一种6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体。区别于已有发表的专利us006090567a(homogeneousimmunoassaysusingmutantglucose-6-phosphatedehydrogenases)的6磷酸葡萄糖脱氢酶的突变体，本申请的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体，其包含选自以下的突变：d306c、g426c、d375c。根据一些实施方案，提供了一种6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体，所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体是选自以下的序列所示：seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4。根据一些实施方案，提供了一种多核苷酸，其编码本申请的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体。根据一些实施方案，提供了一种表达载体，其包含本申请的多核苷酸。根据一些实施方案，提供了一种宿主细胞，其包含本申请的表达载体。宿主细胞可以是原核(如细菌)或真核(如酵母)。根据一些实施方案，提供了一种偶联物，其是本申请的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体与半抗原按照摩尔比1：n偶联而成。在一些实施方案中，n是1至50，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50。在一些具体的实施方案中，本申请的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体与半抗原按照摩尔比优选为1：1。在一些具体的实施方案中，半抗原的分子量为100da至4000da，例如：100、150、200、250、300、350、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、520、550、570、600、620、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000。根据本申请，技术人员将理解，“半抗原”还包含其衍生物的形式。为了便于和6-磷酸葡萄糖脱氢酶进行偶联，对于那些自身不带有偶联基团(例如，与巯基反应的基团)的半抗原(例如阿米卡星)，可以经改造而带有接头，以便和巯基共价结合。因此，在本申请中，半抗原衍生物是指，经改造而带有巯基反应基团的半抗原。半抗原选自：小分子药物(如抗生素、精神药物)、激素、代谢物、糖、脂质、氨基酸。半抗原例如但不限于：茶碱、苯妥英、维生素d、25羟维生素d、1，25双羟维生素d、叶酸、强心甙(包括地高辛、洋地黄毒苷)、酶酚酸、雷帕明、环胞菌素a、乙胺碘复酮、甲胺喋呤、他克莫司、血清氨基酸、胆汁酸、甘胆酸、苯丙氨酸、乙醇、尿尼柯丁代谢产物柯替宁、尿吗啡、尿单羟酚衍生物、神经肽酪氨酸、血浆甘丙素、多胺、组织胺、促甲状腺激素、泌乳素、胎盘泌乳素、生长激素、促卵泡刺激素、促黄体生成素、促肾上腺皮质激素、抗利尿激素、降钙素、降钙素原、甲状旁腺激素、甲状腺素、三碘甲状原氨酸、反三碘甲状原氨酸、游离甲状腺素、游离三碘甲状原氨酸、皮质醇、尿17-羟皮质类固醇、尿17-酮类固醇、脱氢表雄酮及硫酸酯、醛固酮、尿香草苦杏仁酸、血浆肾素、血管紧张素、促红细胞生成素、睾酮、双氢睾酮、雄烯二酮、17α羟孕酮、雌酮、雌三醇、雌二醇、孕酮、人绒毛膜促性腺激素、胰岛素、胰岛素原、c肽、胃泌素、血浆前列腺素、血浆6-酮前列腺素f1α、前列环素、肾上腺素、儿茶酚胺、去甲肾上腺素、胆囊收缩素、纳素、环磷酸腺苷、环磷酸鸟苷、血管活性肽、生长抑素、促胰液素、p-物质、神经降压素、血栓素a2、血栓素b2、5羟色胺、神经肽y、骨钙素。在具体的实施方案中，半抗原是阿米卡星或其衍生物。在具体的实施方案中，半抗原是阿米卡星衍生物，其带有巯基反应基团，例如来酰亚胺、溴乙酰基、乙烯基砜或氮丙啶。在具体的实施方案中，半抗原是阿米卡星衍生物，如式i所示：其中，在一些实施方案中，m为1至10的整数，优选1至5的整数，例如1、2、3、4、5。在一些具体的实施方案中，阿米卡星衍生物具有式ii所示的结构：根据一些实施方案，提供了一种试剂，其包含本申请的偶联物。根据一些实施方案，提供了本申请的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体在制备阿米卡星检测试剂中的用途。根据一些实施方案，提供了本申请的偶联物在制备阿米卡星检测试剂中的用途。在具体的实施方案中，所述的检测试剂选自：酶联免疫法检测试剂、化学发光免疫法检测试剂、均相酶免疫法检测试剂、胶乳增强免疫比浊法检测试剂。在具体的实施方案中，所述的检测试剂优选是基于竞争法检测的试剂。根据一些实施方案，提供了本申请的偶联物在制备阿米卡星检测装置中的用途。在具体的实施方案中，所述的检测装置可以制备成孔板(例如96-孔板)的形式，比如板上包被根据本申请的试剂。在具体的实施方案中，所述的检测装置可以制备成颗粒(例如胶乳、磁珠)的形式，比如颗粒上包被根据本申请的试剂。根据一些实施方案，提供了一种阿米卡星检测试剂盒，其包含：-第一试剂，所述第一试剂包含底物、缓冲液和阿米卡星抗体；所述底物是6-磷酸葡萄糖脱氢酶的底物；-第二试剂，所述第二试剂包含本申请的偶联物和缓冲液；-任选地，校准品，所述校准品包含10mm至500mm缓冲液、0μg/ml至50μg/ml阿米卡星(例如0、3、5、10、20、30、35、40、45、50μg/ml或之间的任意值)；以及-任选地，质控品，所述质控品包含10mm至500mm缓冲液、3μg/ml至40μg/ml(例如3、4、5、10、20、30、40μg/ml或之间的任意值)阿米卡星。根据一个实施方案，提供了一种阿米卡星检测试剂盒，其包含：第一试剂，其包含：10mm至500mm缓冲液、5mm至50mm底物、0.01μg/ml至10μg/ml阿米卡星抗体(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.5、2、3、4、5μg/ml)、0.1g/l至5g/l稳定剂、0.1g/l至5g/l表面活性剂、0.1g/l至5g/l防腐剂；第二试剂，其包含：10mm至500mm缓冲液、0.01μg/ml至10μg/ml根据本申请的偶联物(0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0μg/ml)、0.1g/l至5g/l稳定剂、0.1g/l至5g/l表面活性剂、0.1g/l至5g/l防腐剂。在一些实施方案中，所述缓冲液选自以下的一种或组合：taps、氨基丁三醇缓冲液、磷酸盐缓冲液、tris-hcl缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、巴比妥缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、三羟甲基甲烷缓冲液；优选，磷酸盐缓冲液；所述缓冲液的浓度为10mmol/l至500mmol/l，优选50至100mm；所述缓冲液的ph为7至8。在一些实施方案中，所述稳定剂选自以下的一种或组合：牛血清白蛋白、海藻糖、甘油、蔗糖、甘露醇、甘氨酸、精氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000；优选牛血清白蛋白。在一些实施方案中，所述表面活性剂选自以下的一种或组合：brij35、tritonx-100、tritonx-405、tween20、tween30、tween80、椰子油脂肪酸二乙醇酰胺、aeo7，优选tween20。在一些实施方案中，所述的防腐剂选自以下的一种或组合：叠氮化物、mit、生物防腐剂pc(如pc-300)、硫柳汞；所述叠氮化物选自：叠氮钠、叠氮锂。在一些实施方案中，所述底物包含：6-磷酸葡糖糖、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。在一些具体的实施方案中，所述阿米卡星抗体源自：小鼠、大鼠、猫、犬、灵长类、牛、马、羊、骆驼科、禽、人。在一些具体的实施方案中，所述阿米卡星抗体选自：单抗、多抗、重组抗体、嵌合抗体、抗原结合片段。根据一些实施方案，提供了一种偶联物的制备方法，包括步骤：1)提供根据本申请的阿米卡星衍生物，尤其是在非质子性溶剂(例如但不限于乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜)中提供根据本申请的阿米卡星衍生物；2)提供6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体，优选在缓冲液(其提供反应环境，例如但不限于pbs、tris、taps、tapso，所述缓冲液ph为6.0至8.0)中提供6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体；3)在18℃至28℃，将所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体和所述阿米卡星衍生物，按照阿米卡星衍生物：酶＝500：1至1：500摩尔比(优选50：1至1：50)接触1小时至4小时(1、1.5、2、2.5、3、3.5、4小时、或之间的任何值，优选2小时至3小时)使得所述阿米卡星衍生物和所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体发生偶联，得到所述种偶联物；4)根据需要，任选对所述种偶联物进行纯化，例如脱盐处理等。在一些实施方案中，反应体系中半抗原和酶的接触摩尔比1：n，其中n是1至500，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、100、200、300、400、500及其任意上述数值之间的范围；优选50。在一些实施方案中，反应体系中半抗原和酶的接触摩尔比n：1，其中n是1至500，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、100、200、300、400、500及其任意上述数值之间的范围；优选50。在一些具体的实施方案中，步骤1)和2)可互换或并行。在一些具体的实施方案中，在偶联之前，所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶包含一个或多个游离的巯基，从而允许和阿米卡星实现定向反应。野生型6-磷酸葡萄糖脱氢酶不含游离的巯基，因此在一些具体的实施方案中，6-磷酸葡萄糖脱氢酶是经过基因工程改造的，使其在特定位点(306、375或426位)上的氨基酸突变为半胱氨酸，从而带有一个游离巯基。附图说明图1.g6pdh(野生型)氨基酸序列(seqidno.1)；源自明串珠菌属假肠膜明串珠菌leuconostocpseudomesenteroides。图2.g6pdh(d306c)氨基酸序列(seqidno.2)。图3.g6pdh(d375c)氨基酸序列(seqidno.3)。图4.g6pdh(g426c)氨基酸序列(seqidno.4)。具体实施方式实施例实施例1.阿米卡星衍生物的合成按照上述流程，将阿米卡星(123mg，0.21mmol)和化合物1(64mg，0.21mmol)溶于水5ml中，室温(18-28℃)搅拌5h。hplc分离得到阿米卡星衍生物(100mg，61％)。经质谱和核磁鉴定，阿米卡星衍生物结构正确无误。本实施例使得阿米卡星带有一个可以和酶结合的基团。实施例2.阿米卡星衍生物与g6pdh分子的偶联一、本申请的偶联方法根据本申请的g6pdh-阿米卡星偶联物，按照以下方式进行偶联：阿米卡星衍生物分子上的巯基反应性基团(如但不限于马来酰亚胺基团)与g6pdh分子上的巯基共价结合。1.将实施例1制备的阿米卡星衍生物溶于n,n-二甲基甲酰胺中(10mg/ml)；2.g6pdh溶液：g6pdh突变体溶于pb100mmol、nacl100mmol，ph8.0，6mg/ml；3.将200μlg6pdh溶液加入至750μl缓冲溶液(0.05mna2hpo4、150mmnacl、10mmedta、0.1％nan3、ph＝7.2)中；然后向其中加入阿米卡星衍生物的n,n-二甲基甲酰胺溶液50μl；4.上述混合溶液，在室温(18-28℃)下充分震荡2-3小时，脱盐处理，收集蛋白峰，所得产物即g6pdh-阿米卡星偶联物。二、对照偶联方法准确称取100至300mg阿米卡星，并用5至15ml无水乙醇溶解；在上述溶液中滴加10至200mm的高碘酸钠5至15ml，并轻微振荡，室温搅拌反应0.5-2小时；滴加0.5至2m的乙二醇0.5至1ml，室温搅拌反应5至10分钟；将上述反应混合物滴加到5至15ml正在搅拌中的2至3％的g6pdh溶液中，并调节溶液ph到9.0至9.5，继续搅拌反应0.5至2小时，并使溶液ph稳定；加入100至200mg四氢硼钠，搅拌还原12至24小时；通过g-25凝胶层析柱纯化得到g6pdh-阿米卡星偶联物。实施例3.试剂盒的制备制备以下检测阿米卡星的试剂盒，其包含：试剂r1，包含：tris缓冲液100mm，ph7.010mm6-磷酸葡萄糖10mmβ-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.5μg/ml阿米卡星抗体(市售抗体，无特殊限制)1g/l牛血清白蛋白1g/ltween801g/l叠氮钠；试剂r2，包括：mes缓冲液200mm，ph8.00.1μg/mlg6pdh-阿米卡星偶联物100mmnacl1g/l牛血清白蛋白1g/ltween801g/l叠氮钠；校准品：20mmhepes缓冲液，以及0μg/ml、3μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、35μg/ml、50μg/ml阿米卡星(或按需加入)；质控品：20mmhepes缓冲液，以及4-5μg/ml、14-16μg/ml、28-32μg/ml阿米卡星(或按需加入)。将上述试剂(任选包含质控品、校准品)，组装成阿米卡星均相酶免疫检测试剂盒。检测例均相酶免疫测定的原理：在液体均相反应体系中，酶标记抗原(如g6pdh-阿米卡星)与非标记抗原(阿米卡星)，竞争与定量的抗体(阿米卡星抗体)进行结合，当抗体与非标记抗原结合越多，酶标记抗原释放的活性就越多，酶催化底物nad+生成nadh就越多。在340nm波长下检测nadh的吸光度变化，即可推算出液体中阿米卡星的含量。表1.全自动生化仪参数检测机型雅培c16000分析/时间/读点速率/10min/28-33r1/r2/s150：50：3波长(副/主)405/340反应类型递增校准类型spine校准点6校准品浓度0/3/10/20/35/50检测例1.本申请试剂盒的性能1.定标实验表2.阿米卡星检测试剂盒定标吸光度2.精密度实验表3.总不精密度3.重复性表4.重复性4.回收测试表5.回收数据5.线性实验表6.线性检测例2.加速稳定性本申请试剂(g426突变体)37℃加速7天后，定标吸光度下降小于5％，对照试剂37℃加速7天后，定标吸光度下降显著。表7.37℃加速稳定性检测例3.抗体抑制率1.抗体抑制率的检测原理当抗体与g6pdh-阿米卡星偶联物结合时，由于空间位阻导致g6pdh酶活性受到影响，从而使得其催化nad转化为nadh的效率降低，通过检测nadh量的变化，从而比较加入抗体与未加入抗体的实验组的差异，这种差异即体现为抗体对g6pdh的抑制能力。2.反应体系表8.抗体抑制率的检测试剂制备3.结果比较加入抗体与未加入抗体时，分别检测g6pdh-阿米卡星偶联物吸光度测值，即可得到抗体对g6pdh的抑制情况。抗体抑制率＝(1-含抗体时g6pdh-阿米卡星偶联物的吸光度变化值/不含抗体时g6pdh-阿米卡星的吸光度变化值)×100％。相对于已发表的突变位点(a45c)，本申请的突变体在酶活性保留方面有明显提高，能达到39％以上(g426c：39％；d375c：48％)，最高达60％(d306c)。将已发表的突变位点(例如a45c、k55c)参照本申请的方法制备成g6pdh-阿米卡星偶联物，其抑制率仅为32％和38％。虽然不限于具体理论，但是可以部分地解释为：和现有技术中的g6pdh突变体(a45c、k55c)相比，本申请酶突变体中突变位点(即引入游离巯基的位点)是和半抗原(比如激素、小分子药物等)发生偶联的位置所在。半抗原在这个位置上与半抗原特异性抗体结合时，所构成的空间位阻对g6pdh酶的活性影响最大，同时在引入突变后，还不能实质上影响分子的空间折叠。因此，这个突变位点的位置非常重要，需要同时兼顾g6pdh酶的活性、偶联分子的空间折叠、以及半抗原表位的充分暴露。由于酶的突变体在抗体抑制率上有明显的提高。将酶的突变体与阿米卡星偶联后的偶联物配制成试剂盒后，试剂在批间变异系数、线性、重复性、稳定性等性能方面有明显的性能提升。序列表<110>北京九强生物技术股份有限公司<120>6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备阿米卡星检测试剂中的用途<130>390267cg<150>201910017764.4<151>2019-01-09<150>201910423122.4<151>2019-05-21<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>486<212>prt<213>明串珠菌属假肠膜明串珠菌(leuconostocpseudomesenteroides)<400>1metvalsergluilelysthrleuvalthrphepheglyglythrgly151015aspleualalysarglysleutyrproservalpheasnleutyrlys202530lysglytyrleuglnlyshisphealailevalglythralaarggln354045alaleuasnaspaspgluphelysglnleuvalargaspserilelys505560aspphethraspaspglnalaglnalaglualapheilegluhisphe65707580sertyrargalahisaspvalthraspalaalasertyralavalleu859095lysglualailegluglualaalaasplyspheaspileaspglyasn100105110argilephetyrmetservalalaproargphepheglythrileala115120125lystyrleulyssergluglyleuleualaaspthrglytyrasnarg130135140leumetileglulyspropheglythrsertyraspthralaalaglu145150155160leuglnasnaspleugluasnalapheaspaspasnglnleuphearg165170175ileasphistyrleuglylysglumetvalglnasnilealaalaleu180185190argpheglyasnproilepheaspalaalatrpasnlysasptyrile195200205lysasnvalglnvalthrleusergluvalleuglyvalglugluarg210215220alaglytyrtyraspthralaglyalaleuleuaspmetileglnasn225230235240histhrmetglnilevalglytrpleualametglulysprogluser245250255phethrasplysaspileargalaalalysasnalaalapheasnala260265270leulysiletyraspglualagluvalasnlystyrpheglyargala275280285glntyrglyalaglyaspseralaaspphelysprotyrleugluglu290295300leuaspvalproalaaspserlysasnasnthrpheilealaglyglu305310315320leuglnpheaspleuproargtrpgluglyvalprophetyrvalarg325330335serglylysargleualaalalysglnthrargvalaspilevalphe340345350lysalaglythrpheasnpheglysergluglnglualaglngluala355360365valleuserileileileaspprolysglyalailegluleulysleu370375380asnalalysservalgluaspalapheasnthrargthrileaspleu385390395400glytrpthrvalseraspgluasplyslysasnthrprogluprotyr405410415gluargmetilehisaspthrmetasnglyaspglyserasnpheala420425430asptrpasnglyvalserilealatrplysphevalaspalaileser435440445alavaltyrthralaasplysalaproleugluthrtyrlyssergly450455460sermetglyproglualaserasplysleuleualaalaasnglyasp465470475480alatrpvalphelysgly485<210>2<211>486<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>variant<222>(306)..(306)<223>g6pdh突变体,相较于野生型，306位的d替换为c<400>2metvalsergluilelysthrleuvalthrphepheglyglythrgly151015aspleualalysarglysleutyrproservalpheasnleutyrlys202530lysglytyrleuglnlyshisphealailevalglythralaarggln354045alaleuasnaspaspgluphelysglnleuvalargaspserilelys505560aspphethraspaspglnalaglnalaglualapheilegluhisphe65707580sertyrargalahisaspvalthraspalaalasertyralavalleu859095lysglualailegluglualaalaasplyspheaspileaspglyasn100105110argilephetyrmetservalalaproargphepheglythrileala115120125lystyrleulyssergluglyleuleualaaspthrglytyrasnarg130135140leumetileglulyspropheglythrsertyraspthralaalaglu145150155160leuglnasnaspleugluasnalapheaspaspasnglnleuphearg165170175ileasphistyrleuglylysglumetvalglnasnilealaalaleu180185190argpheglyasnproilepheaspalaalatrpasnlysasptyrile195200205lysasnvalglnvalthrleusergluvalleuglyvalglugluarg210215220alaglytyrtyraspthralaglyalaleuleuaspmetileglnasn225230235240histhrmetglnilevalglytrpleualametglulysprogluser245250255phethrasplysaspileargalaalalysasnalaalapheasnala260265270leulysiletyraspglualagluvalasnlystyrpheglyargala275280285glntyrglyalaglyaspseralaaspphelysprotyrleugluglu290295300leucysvalproalaaspserlysasnasnthrpheilealaglyglu305310315320leuglnpheaspleuproargtrpgluglyvalprophetyrvalarg325330335serglylysargleualaalalysglnthrargvalaspilevalphe340345350lysalaglythrpheasnpheglysergluglnglualaglngluala355360365valleuserileileileaspprolysglyalailegluleulysleu370375380asnalalysservalgluaspalapheasnthrargthrileaspleu385390395400glytrpthrvalseraspgluasplyslysasnthrprogluprotyr405410415gluargmetilehisaspthrmetasnglyaspglyserasnpheala420425430asptrpasnglyvalserilealatrplysphevalaspalaileser435440445alavaltyrthralaasplysalaproleugluthrtyrlyssergly450455460sermetglyproglualaserasplysleuleualaalaasnglyasp465470475480alatrpvalphelysgly485<210>3<211>486<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>variant<222>(375)..(375)<223>g6pdh突变体,相较于野生型，375位的d替换为c<400>3metvalsergluilelysthrleuvalthrphepheglyglythrgly151015aspleualalysarglysleutyrproservalpheasnleutyrlys202530lysglytyrleuglnlyshisphealailevalglythralaarggln354045alaleuasnaspaspgluphelysglnleuvalargaspserilelys505560aspphethraspaspglnalaglnalaglualapheilegluhisphe65707580sertyrargalahisaspvalthraspalaalasertyralavalleu859095lysglualailegluglualaalaasplyspheaspileaspglyasn100105110argilephetyrmetservalalaproargphepheglythrileala115120125lystyrleulyssergluglyleuleualaaspthrglytyrasnarg130135140leumetileglulyspropheglythrsertyraspthralaalaglu145150155160leuglnasnaspleugluasnalapheaspaspasnglnleuphearg165170175ileasphistyrleuglylysglumetvalglnasnilealaalaleu180185190argpheglyasnproilepheaspalaalatrpasnlysasptyrile195200205lysasnvalglnvalthrleusergluvalleuglyvalglugluarg210215220alaglytyrtyraspthralaglyalaleuleuaspmetileglnasn225230235240histhrmetglnilevalglytrpleualametglulysprogluser245250255phethrasplysaspileargalaalalysasnalaalapheasnala260265270leulysiletyraspglualagluvalasnlystyrpheglyargala275280285glntyrglyalaglyaspseralaaspphelysprotyrleugluglu290295300leuaspvalproalaaspserlysasnasnthrpheilealaglyglu305310315320leuglnpheaspleuproargtrpgluglyvalprophetyrvalarg325330335serglylysargleualaalalysglnthrargvalaspilevalphe340345350lysalaglythrpheasnpheglysergluglnglualaglngluala355360365valleuserileileilecysprolysglyalailegluleulysleu370375380asnalalysservalgluaspalapheasnthrargthrileaspleu385390395400glytrpthrvalseraspgluasplyslysasnthrprogluprotyr405410415gluargmetilehisaspthrmetasnglyaspglyserasnpheala420425430asptrpasnglyvalserilealatrplysphevalaspalaileser435440445alavaltyrthralaasplysalaproleugluthrtyrlyssergly450455460sermetglyproglualaserasplysleuleualaalaasnglyasp465470475480alatrpvalphelysgly485<210>4<211>486<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>variant<222>(426)..(426)<223>g6pdh突变体,相较于野生型，426位的g替换为c<400>5metvalsergluilelysthrleuvalthrphepheglyglythrgly151015aspleualalysarglysleutyrproservalpheasnleutyrlys202530lysglytyrleuglnlyshisphealailevalglythralaarggln354045alaleuasnaspaspgluphelysglnleuvalargaspserilelys505560aspphethraspaspglnalaglnalaglualapheilegluhisphe65707580sertyrargalahisaspvalthraspalaalasertyralavalleu859095lysglualailegluglualaalaasplyspheaspileaspglyasn100105110argilephetyrmetservalalaproargphepheglythrileala115120125lystyrleulyssergluglyleuleualaaspthrglytyrasnarg130135140leumetileglulyspropheglythrsertyraspthralaalaglu145150155160leuglnasnaspleugluasnalapheaspaspasnglnleuphearg165170175ileasphistyrleuglylysglumetvalglnasnilealaalaleu180185190argpheglyasnproilepheaspalaalatrpasnlysasptyrile195200205lysasnvalglnvalthrleusergluvalleuglyvalglugluarg210215220alaglytyrtyraspthralaglyalaleuleuaspmetileglnasn225230235240histhrmetglnilevalglytrpleualametglulysprogluser245250255phethrasplysaspileargalaalalysasnalaalapheasnala260265270leulysiletyraspglualagluvalasnlystyrpheglyargala275280285glntyrglyalaglyaspseralaaspphelysprotyrleugluglu290295300leuaspvalproalaaspserlysasnasnthrpheilealaglyglu305310315320leuglnpheaspleuproargtrpgluglyvalprophetyrvalarg325330335serglylysargleualaalalysglnthra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