一种地衣子实体显微结构的永久制片方法与流程

本发明涉及地衣制片方法，尤其是一种可以快速制作并永久保存地衣子实体解剖结构的方法。

背景技术：

地衣领域研究子实体结构常规采用徒手制片法，制片率低，厚薄不均，仅作为临时观察之用，无法保存。并且，不同的研究者在开展研究时，可能会对同一份材料再次取样，导致地衣体仅有的繁殖结构被完全破坏，损害地衣标本的完整性。地衣材料本不易获得，因此为改善这种现状，急需寻找方法解决此类难题。采用冷冻切片具有快速、简便、易操作的特点。该技术在动物和人体组织方面有广泛的应用，但在地衣领域中的应用未见有任何报道。比较相近的报道是在少数高等植物组织切片中的应用，但也未见推广。

如公开号为cn103926109a，一种适合快速观测油棕叶片解剖结构的冷冻切片方法。该方法选用进口包埋剂oct(optimumcuttingtemperaturecompound)进行包埋，获得油棕叶片解剖结构的切片。但是进口包埋剂oct价格贵，不易购买。

公开号为cn108037147a，一种用于同步辐射x射线荧光微分析的植物根部冷冻切片制作方法。该方法是将植物根部切成小块，置于改良oct冷冻包埋剂中，在4℃冷藏浸泡一段时间后，再次用改良oct冷冻包埋剂包埋切片。该方法选用的改良oct的组成也比较复杂，不便于推广。

地衣是一种特殊的真菌，它的内部结构和高等植物完全不同，这些在高等植物领域应用的冷冻切片方法不适合于地衣子实体显微结构的制片，因此需要另寻一套快速便捷适合于地衣材料的切片方法。

技术实现要素：

地衣是一种由真菌和藻类(或蓝细菌)构成的复合体，绝大多数地衣的共生菌是子囊菌，子囊菌产生有性生殖的子实体，子实体产生子囊和子囊孢子。在地衣分类鉴定时，子实体的类型及产生孢子的数量、形状和结构等都被作为非常重要的分类依据。本发明的目的是提供一种快速制作并永久保存地衣子实体解剖结构的方法。该方法能够解决在地衣子实体显微结构的观察中，不能快速获得合格显微切片及切片不能永久保存的难题。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：一种地衣子实体显微结构的永久制片方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)软化：将带有子实体的地衣材料采用甘油溶液浸泡并抽真空；

(2)固定：将步骤(1)中得到的材料在固定液中固定并抽真空；

(3)冷冻：将步骤(2)中的材料放置在冷台上用冷冻包埋溶剂进行冷冻包埋；

(4)切片：将步骤(3)中冷冻材料放置到冷冻切片机上切片；

(5)粘片和烤片：在干净的载玻片上均匀涂抹一薄层粘片剂，将步骤(4)中的切片黏附于载玻片上，放在30℃-50℃展台上烘干；

(6)染色：将步骤(5)得到的切片采用乳酸酚棉兰进行染色；

(7)脱水：将步骤(6)中染完色的载玻片依次经不同浓度梯度配比的乙醇和正丁醇溶液进行脱水；

(8)封片：将步骤(7)中脱水后的地衣子实体切片用中性树胶封片保存，室温干燥24小时，即制成可以永久保存的地衣子实体的显微切片。

进一步，所述步骤(1)甘油溶液为1-30％甘油溶液。

进一步，所述步骤(2)固定液包括1-10％铬酸水溶液2-3份，冰醋酸1-2份，福尔马林4-5份。

进一步，所述步骤(4)中箱体温度-16℃—-22℃，样品头温度为-16℃—-22℃，切片厚度设为3-8um。

本发明前期针对地衣材料的特殊性，首先通过一定时间的软化和固定处理，然后采用价廉的胶水替代oct作为冷冻包埋剂，控制箱体和切片头的温度，通过粘片、烤片、染色，最后再经过一系列的脱水处理之后，封片。整个过程周期短，成本低，材料不变形，子实体显微结构清晰，并能长久保存，该方法非常有利于开展地衣子实体解剖结构的观察和分类鉴定学的研究，并易于推广。本发明与现有技术相比，找到了一种快速价廉适合于地衣子实体永久切片的方法。制备的切片薄厚均匀，显微结构清晰，克服了常规制片过程中制片率低，厚薄不均，结构不清，对研究材料反复损伤，切片无法长久保存的难题。

附图说明

图1采用本发明方法的地衣子实体10x显微切片图。

图2采用本发明方法的地衣子实体20x显微切片图。

图3采用本发明方法的地衣子实体40x显微切片图。

具体实施方式

为了阐述本发明的技术方案和技术目的，下面具体实施方式对本发明做进一步介绍。

制作地衣子实体解剖结构永久制片的方法包括如下步骤：1.软化：将带有子实体的地衣材料采用1-30％甘油溶液浸泡10-60分钟，并抽真空；2.固定：将1中的材料用由以下原料(1-10％铬酸水溶液2-3份，冰醋酸1-2份，福尔马林4-5份)配制而成的固定液中固定1-12个小时，并抽真空；3.冷冻：将2中的材料放置在冷台上用胶水(冷冻包埋溶剂)进行冷冻包埋；4.切片：将3中冷冻材料放置到冷冻切片机上，用快进按钮将冷冻样品调整到合适的位置，调节箱体温度-16℃—-22℃，样品头温度为-16℃—-22℃。将切片厚度设为3-8um，切片；5.粘片和烤片：在干净的载玻片上均匀涂抹一薄层粘片剂，将4中的切片黏附于载玻片上，放在30℃-50℃展台上烘30-60分钟；6.染色：采用乳酸酚棉兰进行染色，时间3-10分钟；7.脱水：将染完色的载玻片依次经不同浓度梯度配比的乙醇和正丁醇溶液；8.封片：用中性树胶封片保存，室温干燥24小时。即制成可以永久保存的地衣子实体的显微切片。

如图1所示的，本发明方法获得的显微切片剖面结构完整，放大20倍后如图2，可见子实层、子实层基、藻胞层、髓层、假根，在40倍和油镜下，可清晰地观察到子囊和侧丝的结构，子囊内子囊孢子的形态完整，结构清晰，非常易于测量、计数和鉴别。说明本发明方法获得的显微切片结构完整，没有损坏地衣子实体的显微结构。以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

技术特征：

1.一种地衣子实体显微结构的永久制片方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)软化：将带有子实体的地衣材料采用甘油溶液浸泡并抽真空；

(2)固定：将步骤(1)中得到的材料在固定液中固定并抽真空；

(3)冷冻：将步骤(2)中的材料放置在冷台上用冷冻包埋溶剂进行冷冻包埋；

(4)切片：将步骤(3)中冷冻材料放置到冷冻切片机上切片；

(5)粘片和烤片：在干净的载玻片上均匀涂抹一薄层粘片剂，将步骤(4)中的切片黏附于载玻片上，放在30℃-50℃展台上烘干；

(6)染色：将步骤(5)得到的切片采用乳酸酚棉兰进行染色；

(7)脱水：将步骤(6)中染完色的载玻片依次经不同浓度梯度配比的乙醇和正丁醇溶液进行脱水；

(8)封片：将步骤(7)中脱水后的地衣子实体用中性树胶封片保存，室温干燥24小时，即制成可以永久保存的地衣子实体的显微切片。

2.根据权利要求1所述的一种地衣子实体显微结构的永久制片方法，其特征在于，所述步骤(1)甘油溶液为1-30％甘油溶液。

3.根据权利要求1所述的一种地衣子实体显微结构的永久制片方法，其特征在于，所述步骤(2)固定液包括1-10％铬酸水溶液2-3份，冰醋酸1-2份，福尔马林4-5份。

4.根据权利要求1所述的一种地衣子实体显微结构的永久制片方法，其特征在于，所述步骤(4)中箱体温度-16℃—-22℃，样品头温度为-16℃—-22℃，切片厚度设为3-8um。

技术总结
本发明公开了一种快速制作并永久保存地衣子实体解剖结构的方法。该方法能够解决在地衣子实体显微结构的观察中，不能快速获得合格显微切片及切片不能永久保存的难题。首先通过一定时间的软化和固定处理，然后采用价廉的胶水替代OCT作为冷冻包埋剂，控制箱体和切片头的温度，通过粘片、烤片、染色，最后再经过一系列的脱水处理之后，封片。整个过程周期短，成本低，材料不变形，子实体显微结构清晰，并能长久保存，避免了对研究材料的反复损伤。该方法非常有利于开展地衣子实体解剖结构的观察和分类鉴定学的研究，并易于推广。

技术研发人员：牛东玲;韩晓鹏;余德菊;苗申奥
受保护的技术使用者：宁夏大学
技术研发日：2020.01.19
技术公布日：2020.06.05