一种赤芝水提物蛋白成分及其分析与鉴定方法与流程

[0001]
本申请涉及一种赤芝水提物中蛋白质及其水解多肽成分，及其分析与鉴定的方法。


背景技术：

[0002]
灵芝是我国传统名贵中药材。《中国药典》中收录灵芝中的赤芝ganoderma lucidum(leyss.ex fr.)karst.和紫芝ganoderma sinense zhao,xu et zhang两个品种
[1]
。其中，赤芝味苦平，多用于治疗各种肝脏和心脑血管疾病，为灵芝中的代表种。紫芝味甘温，多用于食疗保健。近20年来，赤芝已实现了人工种植，广泛用于人们的医疗保健过程中。经本草考证和历史文献考实，浙江、安徽为赤芝的道地产区，可作为开发赤芝药用资源的首选地
[2]
。
[0003]
随着生物技术的发展，赤芝的基因组已经得到了测定。赤芝(g.lucidum)为一种具有很大的种内多样性的复合物种。据报道，欧洲和东亚的赤芝在形态、分子亲缘关系与三萜成分都有所不同
[3-4]
。目前，已在美国国立生物技术信息中心(national center for biotechnology information,ncbi)公布了亚洲赤芝(g.lucidum)基因组的组装序列，所测序的赤芝菌株包括bcrc 36111、bcrc37177
[5]
、g.260125-1
[6]
以及xiangnong no.1
[7]
。其中代表性的赤芝序列为2012年chen等发布的赤芝(g.260125-1)的基因组数据
[6]
。该赤芝菌株是从原生质体单核化而得来，双核菌株cgmcc5.0026属于亚洲g.lucidum类群，来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心。这些亚洲灵芝品种的基因组注释并不十分完善，由基因组预测的蛋白质大部分也尚未公布。迄今为止，在ncbi中能查到的亚洲赤芝蛋白质仅有697个，其中非重复蛋白仅有357个。2013年，美国能源部联合基因组研究所(the u.s.department of energy joint genome institute,jgi)也发表了北美赤芝(ganoderma lucidum sp.10597)的基因组数据，参见https://genome.jgi.doe.gov/gansp1/gansp1.home.html
[8]
。其中，北美赤芝(ganoderma lucidum sp.10597)基因组序列注释较完整，预测得出289550个蛋白序列已公布。
[0004]
中国传统灵芝服用方法为水煎或炖煮，其中尤以赤芝水煎服对多种疾病具有良好疗效。研究表明，赤芝水提物具有多种药理学活性
[9-10]
。赤芝水提物中的主要成分包含多糖、三萜、蛋白及其水解肽类物质。以往认为赤芝多糖与三萜类物质是赤芝的主要活性成分
[11]
。但是，有关报道表明，灵芝蛋白有多种类型，包括真菌免疫调节蛋白、凝集素、糖蛋白、酶等，在灵芝发挥免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗菌和抗病毒方面具有显著效果
[12]
。在前期研究中，申请人获得一种中国赤芝通过微波处理得到的水提取物，该水提物具有较为显著的抗菌消炎的特性，但其中的蛋白类成分尚不清楚。随着质谱技术的发展，质谱技术越来越多地用于蛋白质或多肽的高通量解析与含量测定。然而，迄今为止，尚未见到利用质谱技术分析与鉴定赤芝水提物中蛋白质及多肽类成分的相关报道。可见，中国赤芝中的蛋白序列和功能还有很多尚未揭示。
[0005]
参考文献
no.2所示的氨基酸序列，第三蛋白质具有seq id no.3所示的氨基酸序列，第四蛋白质具有seq id no.4所示的氨基酸序列，第五蛋白质具有seq id no.5所示的氨基酸序列，第六蛋白质具有seq id no.6所示的氨基酸序列。
[0021]
本申请还涉及一种赤芝水提物，其为赤芝液氮研磨水提物，其还包含第七蛋白质、第八蛋白质或它们的组合，其中第七蛋白质具有seq id no.7所示的氨基酸序列，第八蛋白质具有seq id no.8所示的氨基酸序列。
[0022]
根据本申请所述的赤芝水提物，其还包括蛋白、多糖与三萜类物质。
[0023]
特别地，赤芝微波水提物为赤芝通过微波处理得到的水提取物，优选将赤芝切1-5毫米片，浸泡吸水，置微波频率为915mhz-2450mhz，在60-100℃之间处理1-10分钟，回收冷凝水提物；另外，特别地，赤芝切片液氮研磨水提物为赤芝切片在液氮中研磨成粉后，通过水提取得到的产物。
[0024]
另一方面，本申请涉及用于分析赤芝水提物的方法，其包括通过纳升级反向液相色谱-串联质谱方法(nanorplc-ms/ms)进行赤芝水提物的分析。
[0025]
本申请还涉及用于分析赤芝水提物的方法，其在通过纳升级反向液相色谱-串联质谱方法进行赤芝水提物的分析之前，还包括以下步骤：
[0026]
(1)通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)进行赤芝水提物中的蛋白质分离；
[0027]
(2)通过胶内酶解进行赤芝水提物中的蛋白质酶解。
[0028]
再一方面，本申请涉及用于鉴定赤芝水提物的方法，其包括以下步骤：
[0029]
(1)通过纳升级反向液相色谱-串联质谱方法来分析赤芝水提物；
[0030]
(2)通过分析得到的质谱数据来搜索亚洲赤芝蛋白质数据，以得到蛋白质序列；
[0031]
(3)将所述蛋白质序列与美国国立生物技术信息中心(ncbi)的非冗余蛋白(nr)数据库进行比对注释。
[0032]
特别地，赤芝水提物为赤芝微波水提物，将其通过比对注释得到25种蛋白产物，含量高的有6种蛋白质，蛋白质具有seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6所示的氨基酸序列；或赤芝水提物为赤芝液氮研磨水提物，将其通过比对注释得到13种蛋白质，含量高的两种蛋白质具有seq id no.7、seq id no.8所示的氨基酸序列。
[0033]
本申请灵芝水提物可以显示出抗菌消炎或提高人体免疫力的功效。此外，本申请首次提供了赤芝蛋白质序列8种。在8种赤芝蛋白质序列中，包括赤芝微波水提物中的最为丰富的6种蛋白质，赤芝切片液氮研磨水提物中最为丰富的2种蛋白质。赤芝水提物中所含的单独蛋白质或蛋白质的组合可以显示出抗菌消炎或提高人体免疫力的功效。
附图说明
[0034]
下面结合附图，对本申请进行进一步说明，但本申请的范围并不仅限于此。附图中：
[0035]
图1为赤芝微波水提物与赤芝切片液氮研磨水提物sds-page胶分离后的考染与银染图。其中图a表示赤芝微波水提物与赤芝切片液氮研磨水提物的考马斯亮蓝染色图。上样依次为，m：marker；1、赤芝微波水提物(4ml赤芝水提物浓缩成40μl上样)；2、赤芝切片液氮研磨水提物(40μl)。图b表示赤芝微波水提物与赤芝切片液氮研磨水提物的银染图。上样依
次为，m：marker；1、赤芝微波水提物(4ml赤芝水提物浓缩成40μl上样)；2、赤芝切片液氮研磨水提物(40μl)。
[0036]
图2为赤芝微波水提物的液相色谱-质谱洗脱梯度图。其中横坐标轴为洗脱时间，纵坐标轴为洗脱百分比，a、b分别代表a相与b相。
[0037]
图3为赤芝微波水提物基峰色谱(bpc)图。
[0038]
图4为赤芝切片液氮研磨水提物的基峰色谱(bpc)图。
具体实施方式
[0039]
本申请首次提供了两种赤芝水提物中最为丰富的8种蛋白质。其中，提供了赤芝微波水提物中最为丰富的6种蛋白质成分。赤芝切片液氮研磨水提物中最为丰富的2种蛋白质成分。该成分可以供开发赤芝水提物相关药品或食品借鉴，或作为相关产品质量标准，本领域技术人员可以借鉴本文内容来实现。特别需要指出的是，本领域技术人员针对本申请的实施方案能够进行替换和修改，并且都包括在本申请的范围内。
[0040]
本申请所述蛋白质成分已经通过较佳实施例进行了描述，本领域技术人员可以在不脱离

技术实现要素：
、精神和范围内的前提下对本文所述的蛋白质成分进行修改或适当变更与组合，实现和应用本申请。
[0041]
本申请还提供一种分析赤芝水提物中的蛋白质成分的方法。该分析方法包括以下几个步骤：1、通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)进行赤芝水提物中的蛋白质分离。通过胶内酶解的方法进行赤芝水提物中的蛋白质酶解。2、通过纳升级液相色谱thermo scientic easy-nlc 1000system(nano hplc)串联thermo scientific
tm q exactive
tm
高分辨质谱采集数据(nanohplc-ms/ms)进行赤芝水提物中的多肽鉴定。3、利用maxquant软件将质谱所得数据与亚洲赤芝的蛋白质数据进行检索，得出赤芝水提物中的蛋白质成分及其离子强度。通过比对公共蛋白数据库得出赤芝水提物中蛋白成分可能具有的功能。
[0042]
实施例
[0043]
实施例1赤芝水提物中蛋白质及多肽成分的分离、分析和鉴定
[0044]
将赤芝微波水提物(通过微波法提取来源于安徽省霍山县的赤芝的有效成分后的水溶液)进行低温冷冻浓缩后，与赤芝切片液氮研磨水提物分别上样进行sds-page电泳，并进行了考染和银染(见图1)。可以看出，赤芝微波水提物与赤芝切片液氮研磨水提物都在相似的位置有三条主带。为了进一步分析样品的成分，将分离后的赤芝微波水提物与赤芝切片液氮研磨水物的胶上条带切割下来，然后脱色。具体操作为，将胶切成1立方毫米左右的小粒，加入考染脱色液或银染脱色液，水洗3次，直至脱色完全。加入乙腈、巯基乙醇等试剂使胶粒脱水至胶粒变白，使用双蒸水和乙腈进行混悬清洗。使用胰蛋白质酶工作液(trypsin)进行胶内酶解，在37℃过夜，第二天离心收集酶解上清液，真空冻干，在-20℃保存。
[0045]
将冷冻干燥后的样品使用纳升级反相色谱thermo scientic easy-nlc 1000system(nano hplc)串联thermo scientific
tm q exactive
tm
高分辨质谱采集肽段数据。首先进行反相色谱分析。将实施例1中的冻干粉用20μl 2％甲醇和0.1％甲酸复溶。以12,000转速离心10分钟，吸取上清液上样。采取夹心法上样，上样体积10μl，分离流速350nl/min。色谱条件为：色谱仪为easy-nlc 1000液相仪(thermo scientic,nano hplc)，
色谱柱为c18柱(easy-spray column，c18)。色谱流动相a：100％超纯水，0.1％甲酸(fa)；流动相b：100％乙腈(acn)，0.1％甲酸(fa)；自动进样；梯度洗脱。洗脱梯度参数如下表1所示。洗脱梯度图如图2所示。色谱图分析结果如图3与图4所示。可见，赤芝微波水提物与赤芝切片液氮研磨水提物的主要成分有所不同。
[0046]
表1.纳升级反相色谱洗脱梯度参数
[0047][0048][0049]
采用质谱系统(thermo，q-exactive)进行肽段序列定性与定量分析。质谱ms/ms参数设置：正离子模式；喷雾电压(+)(v)：2000.00，喷雾电压(-)(v)：1500；毛细管温度(+或+-)(℃)：320.00，毛细管温度(-)(℃)：250.0；离子源：nsi，轮廓谱分析采用全扫描模式，质谱扫描范围：300-1400m/z，70,000fwhm分辨率，agc目标3e6，maximun it60ms。结构鉴定采用full scan-ddms2模式，ms2分辨率17,500fwhm，agc目标5e4，maximun it 80ms，隔离窗口3.0m/z，nce 27％，最小填充比(underfill ratio)1.0％，动态排除时间(dynamic exclusion time)18.0s，循环次数(loop count)(topn)20。
[0050]
实施例2赤芝水提物中蛋白质及多肽成分的分析和功能预测
[0051]
maxquant是现代高灵敏度质谱(high resolution of modern spectrometers)结果的分析软件，已经渐渐成为蛋白质组学领域内的标准解决方案之一。本申请将实施例2的赤芝水提物中的多肽成分质谱分析后产生的原始文件用maxquant(1.5.2.8)软件进行搜库并定量。公布的灵芝蛋白质数据信息较少。因此，申请人搜索了已公布的赤芝基因组数据。赤芝为具有很大的种内多样性的复合物种，已公布五种组装的赤芝基因组。本次搜库参考蛋白质数据为美国国立生物技术信息中心(ncbi)公布的亚洲赤芝(ganoderma lucidum g.260125-1)的基因组数据预测得来的蛋白质组数据。搜库参数设置如下：酶切类型为trypsin，母离子质量误差为
±
15ppm。设定肽段序列固定修饰为半胱氨酸的氨乙酰化修饰(羧酰胺甲基化，carboxyamidomethylation)，可变修饰为甲硫氨酸修饰(氧化，oxidation)。最小多肽长度为7个氨基酸，肽段和蛋白质的错误发现率(false discovery rate,fdr)<0.01，最少匹配的单独肽段(unique peptide)数目为1，利用非标记定量技术(label-free quantification,lfq)值进行蛋白质定量，对获得的蛋白质结果过滤掉污染序列、反向序列等，获得最后的结果。所得序列共30种。其中，赤芝微波水提物(l)搜索到的蛋白质有25种，在前述表2和3中的序号分别为1、2、3、4、5、7、8、9、10、11、12、14、15、16、17、18、19、20、21、23、24、25、27、28、30。赤芝切片液氮研磨水提物(ls)搜索所得蛋白质有13种，在前述表2和3中的序号分别为5、6、8、10、12、13、17、18、19、22、25、26、29。赤芝微波水提物(l)和赤芝切片液氮研磨水提物(ls)共有序列有8种，在前述表2和3中的序号分别为5、8、10、12、17、18、19、25。所得30种蛋白质在赤芝微波水提物(l)和赤芝切片液氮研磨水提物(ls)中的离子强度如表2所示。可以看出，赤芝微波水提物与赤芝切片液氮研磨水提物中鉴
定的含量最高的蛋白质有所不同，说明赤芝微波水提物与赤芝切片液氮研磨水提物具有不同的蛋白质及水解多肽成分的组成和含量。经排序，赤芝微波水提物中鉴定蛋白质离子强度最高的前6种蛋白质在前述表2和3中的序号分别为10、25、18、8、15、9，依次对应于序列表中的seq id no.1、2、3、4、5、6。而赤芝切片液氮研磨水提物中鉴定的离子强度最高的2种蛋白质在前述表2和3中的序号分别为12、6，依次对应于序列表中的seq id no.7和seq id no.8。进一步分析表明，seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.7在赤芝微波水提物和赤芝切片液氮研磨水提物这两种水提物中都能够检测到，seq id no.5、seq id no.6只是在赤芝微波水提物检测到的，seq id no.8只是在赤芝液氮研磨水提物检测到的。
[0052]
表2.质谱数据搜库所得蛋白质的离子强度
[0053][0054]
[0055]
注：搜库所得蛋白质1-30为亚洲赤芝ganoderma lucidum g.260125-1的蛋白质，长度代表1-30号亚洲赤芝蛋白质的序列长度；离子强度l代表赤芝微波水提物中搜库所得蛋白质的离子强度；离子强度ls代表赤芝切片液氮水提物搜库所得蛋白质的离子强度。离子强度排序用粗体表示。离子强度为0代表没有检测到。在l和ls中都检测的离子强度用阴影标出。在l中检测到的离子强度1-6位分别用方框标出，在ls中检测到的离子强度前两位的蛋白分别用圆圈标出。
[0056]
为了进一步描述本申请鉴定的30种亚洲赤芝(ganoderma lucidum g.260125-1)蛋白质的功能，申请人将所获得的30种赤芝蛋白质数据与美国国立生物技术信息中心(ncbi)的非冗余蛋白质数据库(nr)蛋白质数据库又进行了比对，通过对获得的同源性较高的蛋白质的功能描述，对数据进行了进一步的注释(表3)。注释结果表明，所得的30种蛋白质中，除2种蛋白质(21,23)已在ncbi的数据库公布，其余28种蛋白质的序列均尚未公布。其中，赤芝微波水提物中离子强度最高的蛋白质(seq id no.1)与蟹味菇(hypsizygus marmoreus)的组蛋白质h4片段(histone h4,partial)具有最高序列相似度(75％)。组蛋白的功能与其细胞定位密切相关，在细胞核内，组蛋白主要参与核小体的构建和染色体的形成，维持基因组稳定和调控基因表达。在应激情况下，组蛋白可以释放至细胞外，作为损伤相关分子模式家族中的重要新成员，在微生物感染及无菌性炎症反应中发挥重要作用。而本申请发现的赤芝微波水提物也具有抗菌消炎的作用。因此，本申请中的赤芝微波水提物的抗菌消炎功能与其中高含量的组蛋白片段具有一定关联。因此，本申请要求保护包含该片段的赤芝微波水提物组合物。除seq id no.1外，赤芝微波水提物中其它含量较高的组分也会具有一定的功能，特别是赤芝微波水提物中的seq id no.5与seq id no.6组分，因此本申请也要求保护蛋白质组分seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6。同时，本申请也要求保护赤芝液氮研磨水提物中含量较为丰富的蛋白组分seq id no.7和seq id no.8。
[0057]
表3.质谱数据搜库nr数据库所得相似度最高的蛋白质及其注释
[0058]