一种酶联免疫分析芯片的制备方法与流程

本发明属于生物材料领域，涉及一种酶联免疫分析芯片的制备方法。

背景技术：

由病毒引起的传染病现在已成为日益重要社会问题，病毒感染的早期发现和防止传染扩大，要求开发出高速且实地简便地测定病毒的器件。酶联免疫分析(enzyme-linkedimmunosorbentassay，elisa)是一种以病毒蛋白质为对象的简便的免疫测定法，结合微芯片进行elisa，可以有效缩短分析时间。但是，由于病毒的成蛋白质一般是微量的，微芯片中的检测当量较少，存在信噪比降低的问题。芯片的信噪比主要受以下因素的影响：①芯片固定的抗体的量、密度，②蛋白质的非特异吸附，③抗体的活性，④抗原、抗体反应的效率等，其中通过将芯片的固相表面进行三维修饰，可以改善上述的①和④，进而改善芯片的信噪比。

技术实现要素：

本发明采用静电喷雾沉积法制备聚苯乙烯(ps)/聚甲基丙烯酸羟乙酯(hema)复合表面，通过调控elisa芯片表面的亲水/疏水特性和三维固相形貌，实现在保持合理抗体接枝率的同时减少来自生物大分子的非特异性媳妇，以利于创制高灵敏度的微分析器件。

技术方案：

本发明中酶联免疫分析芯片的制备方法如下：(1)将聚苯乙烯(ps)颗粒和聚甲基丙烯酸羟乙酯(hema)溶解于体积比1:1的thf和dmf的混合溶剂中，并加入表面活性剂；(2)用静电喷雾沉积(electrospraydeposition,esd)装置将上述溶液喷涂到铝箔上；(3)将铝箔基片浸入20μg/ml的pbs溶液中，依次加入戊二醛，己二胺和抗体，25℃反应10h；(4)使用去离子水清洗基片，并将未使用的基片在-20℃下保存于甘油、乙二醇混合溶液中。

进一步的，步骤(1)中所述聚苯乙烯颗粒的分子量为mw＝4.0×10⁴-9.0×10⁴，聚甲基丙烯酸羟乙酯的分子量为mw＝2.0×10⁴-9.0×10⁴，聚苯乙烯颗粒、聚甲基丙烯酸羟乙酯、混合溶剂的质量比为8:2:90。

进一步的，步骤(1)中所述表面活性剂为tritonx-100，加入量为溶液总质量的0.1％。

进一步的，步骤(2)中所述esd过程中施加电压为20kv，流速为0.005mm/s。

进一步的，步骤(3)中所述的戊二醛的加入量为溶液总质量的0.1-0.2％，己二胺的加入量为溶液总质量的0.2-0.5％，抗体的加入量为溶液总质量的0.005-0.01％。

有益效果

本发明采用静电喷雾沉积法制备聚苯乙烯(ps)/聚甲基丙烯酸羟乙酯(hema)复合表面，通过调控elisa芯片表面的亲水/疏水特性和三维固相形貌，实现在保持合理抗体接枝率的同时减少来自生物大分子的非特异性媳妇，以利于创制高灵敏度的微分析器件。

附图说明

图1为实施例、对比例和空白对照组的吸光度测定对比图。

具体实施方式

实施例一：

(1)将8g聚苯乙烯颗粒(mw＝9.0×10⁴)和2g聚甲基丙烯酸羟乙酯(mw＝5.0×10⁴)溶解于90g体积比1:1的thf和dmf的混合溶剂中，加入0.1gtritonx-100；

(2)用静电喷雾沉积装置将(1)中溶液喷涂到铝箔上，施加电压为20kv，流速为0.005mm/s；

(3)将铝箔基片浸入100ml20μg/ml的pbs中，依次加入0.1g戊二醛，0.2g己二胺和5mg抗促甲状腺激素(anti-tsh)免疫球蛋白，25℃反应10h；

(4)去离子水清洗铝箔基片后，-20℃下保存于甘油、乙二醇混合溶液中。

实施例二：

(1)将8g聚苯乙烯颗粒(mw＝9.0×10⁴)和2g聚甲基丙烯酸羟乙酯(mw＝5.0×10⁴)溶解于90g体积比1:1的thf和dmf的混合溶剂中，加入0.1gtritonx-100；

(2)用静电喷雾沉积装置将(1)中溶液喷涂到铝箔上，施加电压为20kv，流速为0.005mm/s；

(3)将铝箔基片浸入100ml20μg/ml的pbs中，依次加入0.2g戊二醛，0.5g己二胺和10mganti-hrbc，25℃反应10h；

(4)去离子水清洗铝箔基片后，-20℃下保存于甘油、乙二醇混合溶液中。

对比例：

(1)将4g聚苯乙烯颗粒(mw＝9.0×10⁴)和1g聚甲基丙烯酸羟乙酯(mw＝5.0×10⁴)溶解于90g体积比1:1的thf和dmf的混合溶剂中，加入0.1gtritonx-100；

(2)用静电喷雾沉积装置将(1)中溶液喷涂到铝箔上，施加电压为20kv，流速为0.005mm/s；

(3)将铝箔基片浸入100ml20μg/ml的pbs中，依次加入0.1g戊二醛，0.2g己二胺和5mg抗促甲状腺激素(anti-tsh)免疫球蛋白，质量百分比为0.1％的戊二醛溶液中，依次加入己二胺和抗体，25℃反应10h；

(4)去离子水清洗铝箔基片后，-20℃下保存于甘油、乙二醇混合溶液中。

实验：使用实施例一和对比例的样品进行免疫分析。1cm×1cm聚苯乙烯颗粒片经100ml含有50μg/mlanti-tsh和20μg/mlpbs在25℃保持10小时后用去离子水清洗，作为空白对照。三组样品加入含有1wt％bsa的pbs在25℃保持10小时进行封闭后用pbs洗涤，分别注入含有10μiu/mltsh的pbs溶液，再注入含有anti-tshigg–hrp1μg/ml、bsa1wt％的pbs溶液，保持90分钟；用含有1wt％tween20的pbs进行清洗，加入基质(tmb，sumilonhrp显色试剂盒)，在450nm波长处进行吸光度测定。实施例、对比例和空白对照组的信噪比(s/n)分别为1.32、1.02和1.08。

技术特征：

1.一种酶联免疫分析芯片的制备方法，其特征在于，所述芯片的制备方法如下：(1)将聚苯乙烯颗粒和聚甲基丙烯酸羟乙酯溶解于体积比1:1的thf和dmf的混合溶剂中，并加入表面活性剂；(2)用静电喷雾沉积装置将上述溶液喷涂到铝箔上；(3)将铝箔基片浸入20μg/ml的pbs溶液中，依次加入戊二醛，己二胺和抗体，25℃反应10h；(4)使用去离子水清洗基片，并将未使用的基片在-20℃下保存于甘油、乙二醇混合溶液中。

2.根据权利要求1所述的一种酶联免疫分析芯片的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中聚苯乙烯颗粒的分子量为mw＝4.0×10⁴-9.0×10⁴，聚甲基丙烯酸羟乙酯的分子量为mw＝2.0×10⁴-9.0×10⁴，聚苯乙烯颗粒、聚甲基丙烯酸羟乙酯、混合溶剂的质量比为8:2:90。

3.根据权利要求1所述的一种酶联免疫分析芯片的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述表面活性剂为tritonx-100，加入量为溶液总质量的0.1％。

4.根据权利要求1所述的一种酶联免疫分析芯片的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述静电喷雾过程中施加电压为20kv，流速为0.005mm/s。

5.根据权利要求1所述的一种酶联免疫分析芯片的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述的戊二醛加入量为溶液总质量的0.1-0.2％,己二胺的加入量为溶液总质量的0.2-0.5％，抗体的加入量为溶液总质量的0.005-0.01％。

技术总结
本发明公开了一种酶联免疫分析芯片的制备方法，所述芯片制备方法如下：(1)将聚苯乙烯(PS)颗粒和聚甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)溶解于体积比1:1的THF和DMF的混合溶剂中，并加入表面活性剂；(2)用静电喷雾沉积(Electro Spray Deposition,ESD)装置将上述溶液喷涂到铝箔上；(3)将铝箔基片依次浸入戊二醛溶液中，依次加入己二胺和抗体，25℃反应10h；(4)使用去离子水清洗基片，并将未使用的基片在‑20℃下保存于甘油、乙二醇混合溶液中。

技术研发人员：吴绍伟;曹卫东;秦赢赢
受保护的技术使用者：苏州艾博迈尔新材料有限公司
技术研发日：2020.12.04
技术公布日：2021.08.06