1.本发明涉及一种双抗原标记纳米金的方法，可用于胶体金免疫层析试纸条制备等领域。
背景技术：
2.血清抗体检测方式主要有免疫胶体金层析法。其原理是将特异的抗原/抗体先固定于酸类纤维素膜或nc膜等的某一区带，当该干燥的酸类纤维素一端浸入样品后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗原的区域时，样品中相应的抗体即与该抗原发生特异性结合。同时利用金粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处。当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色的斑点；在试纸条制备中，抗原标记纳米金是很重要的一环，目前采取的构建新冠病毒n蛋白抗体试纸条时，金标制备主要由两种抗原分别修饰纳米金（即n蛋白标记，和质控线抗原标记如鸡igy），最后按照一定比例混合而成。这种方法虽然简单，有效，但分开标记也会使得操作步骤繁琐。本发明提供一种双抗原标记纳米金的方法，通过依次标记，可实现一次离心洗涤即可获得所需金标。
3.附图说明：图1：双抗原标记金标在相应抗体显色。
技术实现要素：
4.本发明的目的是针对n蛋白与鸡igy抗体分开标记纳米金的繁琐步骤，提供一种简单的双抗原标记金的制备方法；为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：所述双抗原标记方法为：鸡igy修饰抗原纳米金，取1 ml纳米金，用0.2-0.5 m碳酸钾调节ph值为8.0-9.5，加入鸡igy使得最终浓度为1-20 μg/ml，反应30-120分钟；所述双抗原标记方法为：标记鸡igy后，利用0.2-0.5 碳酸钾调节ph值为9.5-10.5，加入新冠病毒n蛋白至最终浓度为0.1-20μg/ml，反应30-120分钟；所述双抗原标记方法为：标记鸡igy和新冠n蛋白后加入bsa封闭液,使得最终bsa浓度为0.5%-3%，封闭30-120分钟。随后8000-10000rpm离心，弃上清，以ph=9.5的缓冲液洗涤，最后分散于20mm pb+3%蔗糖+0.1%吐温-20+1% bsa ph=8.5的缓冲液中。
具体实施方式
5.以下通过具体的实施例对本发明作进一步说明，有助于本领域的普通技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明；实施例1：双抗原标记纳米金制备：取1 ml纳米金，用0.5 m碳酸钾调节ph值为8.0，加入鸡igy使得最终浓度为10 μg/ml，反应60分钟。随后继续以0.5 碳酸钾调节ph值为10.0，加入
新冠病毒n蛋白至最终浓度为0.1-20μg/ml，反应60分钟。最后加入bsa使得最终bsa浓度为1%，封闭30-120分钟。随后8000-10000rpm离心，弃上清，以ph=9.5的缓冲液洗涤，最后分散于20mm pb+3%蔗糖+0.1%吐温-20+1% bsa ph=8.5的缓冲液中；实施例2：蛋白标记验证：以10 mm pb ph=7.5，3%的海藻糖作为抗体包被液，以1 mg/mlhis-tag抗体在和1 mg/ml的兔抗鸡igy分别在nc膜划线，37oc下干燥。随后将所标记的双抗原标记纳米金以3 ul/cm的速率喷加到预处理的结合垫上，37oc干燥12小时。依次将玻纤样品垫，结合垫，nc膜和吸水纸黏贴至pvc底板上。滴加样品稀释液（10 mm pb 3% nacl， 1% bsa和0.1% pvp），观察his-tag抗体划线和兔抗鸡igy划线的nc膜变化。可观察到his-tag抗体和兔抗igy划线部位显示出红色（图1），表明蛋白标记成功。
技术特征：
1.一种双抗原标记纳米金的方法，其特征在于：所述双抗原为新冠病毒重组n蛋白和鸡igy，通过两种抗原依次标记纳米金,实现同一种金标上标记两种抗原，最后以bsa和酪蛋白钠封闭即可获得所需金标。2.按权利1要求一种双抗原标记纳米金的方法，其特征在于：所述双抗原标记金次序依次为鸡igy,新冠病毒n蛋白。3.按权利1要求一种双抗原标记纳米金的方法，其特征在于：所述标记鸡igy抗体浓度为1-20 μg/ml,新冠病毒n蛋白1-20 μg/ml。4.按权利1要求一种双抗原标记纳米金的方法，其特征在于：所述标记鸡igy标记金的ph值为8.0-9.5，新冠病毒n蛋白标记金的ph值9.5-10.5。5.按权利1要求一种双抗原标记纳米金的方法，其特征在于：所述bsa封闭液浓度为0%-3%或酪蛋白钠0-3%。
技术总结
本发明涉及涉分析检测领域，公开了双抗原标记纳米金的方法，通过一次调节pH值可在同一纳米金表面标记新冠病毒N蛋白和鸡IgY。本发明提供的双抗原标记纳米金的制备方法，可以一步制备检测线和质控线所需的金标，不需要制备两种金标后再混合。使用时，只需将所制备金标喷到结合垫表面，烘干后便可直接使用，省时省力，提高了实验人员的工作效率；本发明提供了一种双抗原标记纳米金的方法，对分析测试领域具有重要意义。重要意义。
技术研发人员：杨治庆 蔡俊宏 宗成利
受保护的技术使用者：海南大学
技术研发日：2020.12.17
技术公布日：2022/6/21