通过单个氧化还原分子的双峰信号实现E-AB传感器免校准的检测方法

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种通过单个氧化还原分子的双峰信号实现e-ab传感器免校准的检测方法。

背景技术：

生物分子识别具有通用性，特异性和高亲和力，这些特性激发了数十年来旨在将生物分子改编为分子传感通用平台的研究。基于电化学适配体(electrochemicalaptamer-based，e-ab)的传感器，是可用于小分子、蛋白质和金属离子的检测平台。e-ab传感器是利用修饰有氧化还原信号分子的配体作为识别元件。当靶分子与适配体结合时会导致其构象变化，从而改变了氧化还原信号分子与电极表面的电子传递效率，利用方波伏安法等电化学方法可检测这种信号变化，最终达到检测靶分子的目的。这一机制也使得e-ab传感器具有足够的灵敏度和选择性，他们在复杂的介质中，如全血，甚至在活体动物中都有良好的表现。

基于电化学适配体(e-ab)的生物传感器由于固定在电极表面上的探针总数和电极间的异质性使得传感器间信号差异很大，因此，这种类型的传感器常常需要校准过程，这在诸如血液样本或体内测试环境中造成不便甚至难以实现，从而极大地限制了生物传感器的广泛临床应用。因此，针对这一难题，如何开发出一种测试过程中无需频繁校准的传感器件，已成为如今的迫切需求。

技术实现要素：

本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，提出一种通过单个氧化还原分子的双峰信号实现e-ab传感器免校准的电化学检测方法。

本发明的一种通过单个氧化还原分子的双峰信号实现e-ab传感器免校准的电化学检测方法，包括如下具体步骤：s1：绘制标准曲线图,将单个氧化还原分子修饰的适配体组装到电位仪的工作电极表面，并将工作电极与电位仪相连，将工作电极放入含有已知浓度靶标的待检测样品中对其用方波伏安法扫描，不断改变待检测样品中的靶标浓度，收集出现的两个峰值信号的峰值电流，并将其进行差值或比率处理，绘制得到峰值电流比率信号或峰值电流差值信号与靶标浓度关系的标准曲线图；s2：将所述工作电极放入含有未知浓度靶标的待检测样品，打开电位仪，收集出现的两个峰值信号的峰值电流，并将其进行差值或比率处理，并根据得到的差值或比率在标准曲线图上找到对应的靶标浓度。

进一步的，所述单个氧化还原分子包括亚甲基蓝或dox。

进一步的，所述待检测样品包括全血。

本发明人发明了一种通过单个氧化还原分子的双峰信号实现e-ab传感器免校准的检测方法，该方法采用了一种广泛使用的信号机制：结合诱导的电子转移动力学变化，我们使用了基于电化学适配体(e-ab)传感器(图1a)作为我们的测试平台，以支持广泛的分子靶标的测量，e-ab传感器有一个氧化还原通道分子修饰的dna或rna探针组成，共价连接到工作电极上，靶标与探针的结合改变了电极表面与氧化还原分子间的电子交换动力学，通过结合诱导构象变化或由于目标的自身体积的影响，产生一个容易被方波伏安法测量到的变化电流(图1b)，本方法通过收集利用电位仪检测到的双峰信号，绘制得到峰值电流比率信号或峰值电流差值信号与靶标浓度关系的标准曲线图，通过检测含有未知浓度靶标的待检测样品的双峰信号，然后对其双峰进行数据处理，即在响应的方波频率上收集两个峰的峰值电流，并将其进行差值或比率处理，即可在标准曲线图中找到对应的靶标浓度，完成检测，利用单个氧化还原分子的产生双峰现象，根据双峰信号对靶标浓度响应的差异性从而实现免校准的检测方法，以适应临床等各种复杂环境条件下的使用，这很大程度上不受基线漂移和传感器制备过程中产生的传感器之间差异。

的影响，从而实现一种对电化学生物传感器的免校准的检测方法，这是电化学生物传感器达到广泛应用的一个重大突破，对今后在临床或各种复杂环境中进行试验打下了坚实基础。

附图说明

图1a为e-ab传感器的原理示例图；

图1b为方波伏安法测量原理；

图2为kanamycin适配体传感器测试过程中产生的双峰随靶标浓度变化情况图；

图3kanamycin适配体传感器在血液中的稳定性曲线图；

图4为kanamycin适配体传感器在血液中峰值电流比率信号与靶标浓度关系的标准曲线图；

图5为检测dox的传感器在全血中的双峰随靶标浓度变化情况图；

图6为测dox的传感器在全血中峰值电流比率信号与靶标浓度关系的标准曲线图。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。

实施例1

1、生物传感器制备

(1)电极清洗

打开chi1040c软件，将电极放入到电解池中，ag/agcl为参比电极，铂丝为对电极；正确操作chi1040c软件并按正确顺序连接好电极后，分别在0.5mnaoh和0.5mh2so4中通过电化学方法清洗电极待用。

(2)传感器制备

取2ul修饰有巯基的kanamycin-dna离心后加入2ul20mm三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液(tcep)室温下还原1h，之后使用缓冲液(pbs)将dna稀释成1um的溶液；将清洗干净的电极用水冲洗后，浸泡在该溶液中，室温下组装2h；随后将电极转入1ml20mm的6-巯基-1-己醇(mch)溶液中，放入4℃冰箱过夜。

2、电化学测试

从冰箱中取出电极并正确连接后，打开chi1040c软件，在10ml的全血溶液中，使用方波伏安法(swv)在多频率下扫描各种浓度下靶标的双峰感应电流。

本实施例通过将修饰有亚甲基蓝的适配体(这里以kanamycin为例说明)组装到金电极(工作电极)表面后，在血液中用chi1040c软件对其用方波伏安法扫描，发现靶标上出现了双峰的现象(图2)，通过稳定性测试，如图3所示，在血液中两个峰值信号的比值在6小时内都能保持很好的稳定性。随后在血液中测定不同kanamycin浓度下的双峰信号其强度及其比值与浓度关系曲线，即在响应的方波频率上收集两个峰的峰值电流，并将其进行比率处理，，结果如图4所示，这很大程度上不受基线漂移和传感器制备过程中产生的传感器之间差异的影响，从而实现一种对电化学生物传感器的免校准的检测方法。

实施例2

在全血溶液中对检测dox的传感器进行电化学检测，使用方波伏安法(swv)在多频率下扫描各种浓度下靶标的双峰感应电流，如图5所示，并将其进行比率处理，绘制得到峰值电流比率信号与靶标浓度关系的标准曲线图，如图6所示。

以上未涉及之处，适用于现有技术。

虽然已经通过示例对本发明的一些特定实施例进行了详细说明，但是本领域的技术人员应该理解，以上示例仅是为了进行说明，而不是为了限制本发明的范围，本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例来做出各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的方向或者超越所附权利要求书所定义的范围。本领域的技术人员应该理解，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围。