1.本发明是一种操作简单的、精确定量的微量蛋白检测技术，属于分子生物学检测技术领域。
背景技术：
2.在蛋白质定量检测技术中，酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，elisa)和放射免疫检测法(radioimmunoassay，ria)较为灵敏。其中elisa首先使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性，然后用酶标记抗体(抗体与某种酶共价连接而成，这种酶标抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性)与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合，从而将酶-抗体-抗原结合在一起形成复合物，洗净未结合的酶之后，滴加底物溶液后，底物可在酶作用下出现颜色反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正相关，在一定的浓度范围内(线性范围)呈正比。因此可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到较高的敏感度，使elisa方法成为一种既特异又敏感的检测方法。然而，由于elisa技术检测的线性范围较窄，因此难以准确定量检测极低浓度的抗原。
3.放射免疫分析ria是一种应用放射性同位素的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合的体外微量分析方法，其原理是使放射性同位素标记的抗原和未标记抗原(待测物)与非足量的特异性抗体竞争性地结合，反应后分离抗原抗体复合物并通过测量放射性而求得未标记抗原的量。由于ria是以放射性标记与非标记抗原竞争性地与抗体结合为理论基础，故又称为竞争性放射饱和分析法。ria法虽然有灵敏、特异、简便易行、用样量少等优点，但是灵敏度也仅至皮摩尔级。另外ria还有会出现交叉反应、假阳性反应，不能灭活降解酶和盐及ph有时会影响结果等缺点，甚至还存在放射性污染。
4.western blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。但是wb技术操作复杂，步骤繁琐，且实验过程中误差因素较多。
5.聚合酶链反应(polymerase chain reaction，pcr)是现代分子生物学技术中最为灵敏的核酸检测技术，理论上可以检测出1个拷贝的模板dna。荧光定量pcr(fluorescence quantitative pcr，fq-pcr)技术又是在pcr技术基础上，通过实时检测伴随pcr的dna合成过程中由于荧光素标记的taqman探针降解而释放的游离荧光素的荧光变化情况，从而能够精确定量起始dna模板的数量。该技术系将耐热dna聚合酶、特异引物、序列特异性taqman探针、dntps底物、模板dna、镁离子等放在同一个缓冲反应体系中，进行反复高温、低温、中温的热循环，以使模板dna变性、引物与模板复性、引物沿模板dna延伸并降解taqman探针，释
放荧光素，荧光强度检测与记录反复进行，而达到靶dna片段在呈2n倍扩增(其中n为热循环次数)的同时，绘制出荧光强度的变化曲线，再根据荧光变化曲线获取其荧光值达到荧光阈值时的循环数即ct值，该ct值与fq-pcr的起始模板数的对数呈线性关系，且线性范围极大，从而可以根据获得的ct值对几乎各个浓度范围的起始的模板数均能进行精确的定量分析。尽管fq-pcr是目前分子检测技术中灵敏度和准确性最高的技术，但因其只能检测dna分子或rna分子(需要先逆转录成cdna，再进行检测)，不能直接用于检测蛋白质，因而在蛋白质定量检测的领域内没能被有效使用。
6.免疫pcr技术是将免疫吸附试验(elisa)与pcr系统结合形成的新蛋白检测系统。目前已有的免疫pcr技术主要由两个部分组成，第一部分的免疫反应类似于普通的酶联的测定过程，首先用待测抗原(如牛血清白蛋白(bsa))包被微滴板孔，再加入相应的特异抗体，于是抗体就与固相上的抗原结合形成抗原抗体复合物，蛋白a-链亲合素(protein a-streptavidin)嵌合体(重组融合蛋白)中的蛋白a部分可与固相上抗原抗体复合物中的抗体igg结合，而链亲合素部分可与生物素化的puc19(质粒dna)(biotin-puc19)中的生物素反应，从而将特定的dna间接吸附于固相；第二部分即通常的pcr检测，即前述第一步中吸附于固相的puc19质粒dna在相应的引物存在下，可经pcr在几小时内而放大数百万倍，pcr产物的多少与固相上抗原的量成正相关，因而根据pcr结果可以对抗原分子的情况进行研究。然而，由于存在pcr扩增的平台期，各个模板浓度不同的pcr反应其达到平台期需要的循环数不同，决定了pcr产物的量并不与起始模板数成正比，因而定量并不准确。另外，目前已有的免疫pcr由于需要对每一个标本的待检抗原均需单独进行包被，而由于标本情况各异，抗原的包被效率、免疫吸附效率不均，同时所采用的生物素化质粒均一性也不足，操作较为繁琐，定量也不够准确，因而应用较少。
7.因此，目前仍然缺乏一种操作简单的、精确定量的微量蛋白质的检测技术。
技术实现要素：
8.本发明旨在提供一种操作简单、能够精确定量微量蛋白质的检测试剂和方法。
9.本发明提供了一种微量蛋白定量检测试剂，包括亲和分子a标记的dna片段和亲和分子b；所述亲和分子b可标记待测蛋白，所述亲和分子a和亲和分子b相互间可特异性结合；所述dna片段序列如seq id no.1所示。
10.进一步地，上述亲和分子a为亲和素，亲和分子b为生物素。
11.进一步地，上述亲和分子a为生物素，亲和分子b为亲和素。
12.进一步地，上述试剂还包括磁珠连接的待测蛋白抗体的二抗。
13.本发明还提供了一种定量检测微量蛋白的方法，包括如下步骤：
14.5、一种定量检测微量蛋白的方法，其特征在于：包括如下步骤：
15.(1).向待测样品中加入磁珠连接的待测蛋白抗体的二抗，得到磁珠-抗体-抗原复合物；
16.(2).使用磁分离器将磁珠-抗体-抗原复合物分离出来；
17.(3).加入过量亲和分子b反应，得到磁珠-抗体-抗原-亲和分子b复合物；
18.(4).加入过量的亲和分子a标记的dna片段反应，得到磁珠-抗体-抗原-亲和分子b-亲和分子a-dna复合物；
19.(5).使用磁分离器将磁珠-抗体-抗原-亲和分子b-亲和分子a-dna复合物分离出来；
20.(6).使用定量pcr技术检测dna片段，以dna片段的相对量计算得到待测蛋白质的量；
21.所述亲和分子a和亲和分子b相互间特异性结合；所述dna片段序列如seq id no.1所示。
22.进一步地，上述亲和分子a为亲和素，亲和分子b为生物素；或所述亲和分子a为生物素，亲和分子b为亲和素。
23.进一步地，上述步骤(1)、步骤(3)和步骤(4)所述反应在反应液中进行，所述反应液为含有1％bsa的pbs。
24.进一步地，上述步骤(1)所述的磁珠-抗体-抗原复合物和步骤(4)所述的磁珠-抗体-抗原-亲和分子b-亲和分子a-dna复合物被固定化试剂固定，所述固定化试剂的用量为反应液体积的0.5～1.5倍，优选为1倍；
25.所述固定化试剂为pbs配制的0.5-5(v/v)％多聚甲醛溶液；或pbs配制的3-6(v/v)％甲醛溶液；或pbs配制的1-3(v/v)％戊二醛溶液；优选地，所述pbs配制的多聚甲醛溶液浓度为1(v/v)％；所述pbs配制的甲醛溶液浓度为4(v/v)％；所述pbs配制的戊二醛溶液浓度为1.2(v/v)％。
26.进一步地，上述步骤(1)还包括使用pbs溶液洗涤除去过量磁珠-抗体的步骤；上述步骤(5)还包括使用洗涤液洗涤除去未形成复合物的亲和分子b和亲和分子a标记的dna片段的步骤，所述洗涤液为含有1mm edta的pbs溶液。
27.进一步地，上述定量pcr技术为实时荧光定量pcr反应，所述实时荧光定量pcr反应体系包含0.2-0.4umol/l上游引物gagcccactggacttct，最优选0.25umol/l，0.2-0.4umol/l下游引物gtgatgttgcgggtctg，最优选0.25umol/l，0.2-0.4umol/l taqman探针ggagggctgtgtcaag,最优选0.25umol/l，taq dna聚合酶1-3u/50ul，最优选1.5u/50ul,0.2-0.5mmol/l dntps最优选0.25mmol/l、及pcr反应缓冲液。
28.更进一步地，上述pcr反应缓冲液包括50～75mmol/l kcl、10～15mmol/l tris.hcl ph8.3、0.01～0.015％明胶；优选地，所述pcr反应缓冲液包括50mmol/l kcl、10mmol/l tris.hcl ph8.3、0.01％明胶
29.更进一步地，上述述实时荧光定量pcr反应，其反应条件为94-96℃2min，94℃10s
→
50℃10s
→
60℃20s，45循环,在60℃20s时检测并记录荧光，读取各个pcr反应的ct值并按照如下公式计算得到待测蛋白的含量：
30.ct＝-1/lg(1+e
x
)*lgx0+lgn/lg(1+e
x
)
31.x0＝y032.进一步地，上述x0为初始模板量，e
x
为扩增效率,n为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量,y0为待测蛋白质的量。
33.本发明具有以下有益效果：本发明操作简单、快捷，能够通过检测dna的荧光值，精确定量确定蛋白质的含量。
34.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
35.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
36.本发明所用原料和设备均为已知产品，可以通过购买市售商品获得。
37.实施例1、本发明对微量蛋白的定量检测
38.步骤1、
39.磁珠-二抗复合物的制备，将400μl磁珠置入400μl 30mm mes(ph6.5)清洗3次，加入60mg/ml nhs溶液50μl和含有60mg/ml edc溶液50μl,36℃孵育1h，再通过400μl 30mm mes(ph6.5)清洗2次，加入二抗80μl，再加入120μl 30mm mes(ph6.5)，在2-6℃放置3小时，再通过400μl pbs(含有1％bsa)清洗4次，2-6℃保存；
40.用反应液重悬获得的磁珠-二抗复合物，反应液为含有1％bsa的pbs，取少量待测蛋白样品与反应液混合，使其反应生成磁珠-抗体-抗原复合物，采用固定化试剂对磁珠-抗体-抗原复合物进行固定，以便耐受严格反复的洗涤。固定化试剂为pbs配制的0.5-5(v/v)％多聚甲醛，其更优选的浓度为1(v/v)％。其它可用的固定化试剂为pbs配制的3-6(v/v)％甲醛，其更优选的浓度为4(v/v)％；pbs配制的1-3(v/v)％戊二醛溶液，该溶液更优选的浓度为1.2(v/v)％。细胞固定化试剂的用量为：相对于反应液添加0.5-1.5倍体积的该固定化试剂，更优选添加1倍体积的该固定化试剂。并用磁分离器分离，用洗涤液洗掉多余的未形成磁珠-抗体-抗原复合物的磁珠-抗体，采用大量pbs对分离获得的磁珠-抗体-抗原复合物充分洗涤。
41.加入过量的生物素，使其反应生成磁珠-抗体-抗原-生物素复合物；
42.步骤2、
43.将亲和素通过低温离心，加入含有特定引物dna的溶液中，引物的5末端与亲和素结合，得到亲和素标记的dna。
44.所述的亲和素标记的引物dna序列为gtgatgttgcgggtctgggagggctgtgtcaagggatgctgaagaagt ccagtgggctc。生物素标记的dna溶解于0.5mg/ml变性鲑鱼精dna，20mm tris，10mm edta(ph 7.5)的缓冲液中；
45.向步骤(1)得到的产品中加入反应液及过量的亲和素标记的dna，使其反应生成磁珠-抗体-抗原-生物素-亲和素-dna复合物，采用固定化试剂对磁珠-抗体-抗原-生物素-亲和素-dna复合物进行固定。并用磁分离器分离之，用洗涤液洗掉多余的未形成磁珠-抗体-抗原-生物素-亲和素-dna复合物的dna，重悬于超纯水中，离心收集dna复合物备用。所述洗涤液为含有1mm edta的pbs溶液。
46.步骤3、
47.通过定量pcr检测分离到的dna含量进而获得待检测的蛋白的含量。
48.实时荧光定量pcr反应体系，包含0.2-0.4umol/l上游引物gagcccactggacttct，最优选0.25umol/l，0.2-0.4umol/l下游引物gtgatgttgcgggtctg，最优选0.25umol/l，0.2-0.4umol/l taqman探针ggagggctgtgtcaag,最优选0.25umol/l，taq dna聚合酶1-3u/50ul，最优选1.5u/50ul,0.2-0.5mmol/l dntps最优选0.25mmol/l、及pcr反应缓冲液。
49.实时荧光定量pcr反应，其反应条件为94-96℃2min，94℃10s
→
50℃10s
→
60℃20s，45循环,在60℃20s时检测并记录荧光。读取各个pcr反应的ct值并以此作为定量的依据。
50.ct＝-1/lg(1+e
x
)*lgx0+lgn/lg(1+e
x
)；
51.x0＝y0。
52.上述x0为初始模板量，e
x
为扩增效率,n为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量,y0为待测蛋白质的量。
53.通过e
x
为扩增效率,n为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量和ct值计算出x0为初始模板量，获取初始dna含量，再通过初始dna的相对量获得待测蛋白质的量。
54.其中1xpcr缓冲液包括50mmol/l kcl、10mmol/l tris.hcl ph8.3、0.01％明胶,最优选1xpcr缓冲液。
55.综上，本发明提供了一种定量检测微量蛋白的试剂，可以通过简单、快捷的方法，利用对dna的荧光值的检测，精确定量确定蛋白质的含量，在微量蛋白的检测领域具有很好的应用前景。