一种评价枸杞根腐病耐受性的方法

1.本发明涉及枸杞种植技术领域，具体为一种评价枸杞根腐病耐受性的方法。


背景技术：

2.枸杞，原产自我国，栽培历史悠久，属于茄科枸杞属植物，多年生落叶灌木，是药食同源重要的中药材。枸杞果实被誉为“红宝”，含有多糖、玉米黄素等成分，具有抗氧化、抗衰老等功效，可以滋补肝肾；枸杞的根皮被称为“地骨皮”，可以解热止咳。改革开放以来，我国枸杞栽培生产发展迅速，目前种植面积和产量稳居世界第一，全国栽培面积达10万公顷以上，年产干果8万吨，深加工系列保健品达10余种，年出口量占总产量的15％左右，出口、内销日益增加，为贫困地区居民脱贫致富、出口创汇做出了很大的贡献。
3.但是，枸杞在生长过程中所要面临的病虫害种类多、数量大，枸杞产业每年都会不同程度的遭受多种病虫危害，导致产量降低、品质变劣。枸杞中的虫害主要有蚜虫、红癭蚊、木虱、负泥虫等。枸杞中的病害主要是由真菌引起，包括黑果病、白粉病、霉斑病、灰斑病、褐斑病、炭疽病、煤污病、枯梢病、枝枯病、腐烂病、根腐病等。其中，根腐病是枸杞栽培中常见的病害，在宁夏普遍发生，主要危害茎部和根部。发病初期，茎部或根部产生不定形病斑，且逐渐腐烂，后期根部外皮脱落，只剩下木质部，夏季高温常引起发病叶片萎蔫。湿度大时，病部长出一层白色至粉红色丝状物，地上部枝条萎缩，叶片变黄或全株枯死。王国珍等对宁夏枸杞根腐病样本进行分析，指出主要有腐皮镰孢菌、串珠镰孢菌(f.moniliforme)、尖孢镰孢菌(f.oxysporum schlecht)和同色镰孢菌(f.concolor reinking)这几种病原菌。
4.为使枸杞免受病虫害的侵袭，每年都要花大量的人力、物力进行防治。但是在防治过程中，由于很多农民欠缺识别枸杞病虫害发生特点以及防治技术的知识，往往导致花了很大成本而达不到应有的效果。因此，我们希望通过建立一套评价枸杞对根腐病耐受性的方法，从而快速简洁的筛选出对根腐病耐受性强的枸杞品种，进而助力枸杞产业的发展。
5.基于此，本发明设计了一种评价枸杞根腐病耐受性的方法，以解决上述问题。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种评价枸杞根腐病耐受性的方法，以解决上述背景技术中提出的农民欠缺识别枸杞病虫害发生特点以及防治技术的知识，往往导致花了很大成本而达不到应有的效果，需要快速简洁的筛选出对根腐病耐受性强的枸杞品种的问题。
7.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种评价枸杞根腐病耐受性的方法，包括以下步骤：
8.s1：将枸杞幼苗于水培箱培养，分别做对照组处理和实验组处理，处理时间为一周和两周；
9.s2：将处理后的枸杞幼苗取根系速冻于液氮中，保存于零下80℃备用；
10.s3：取出不同组的枸杞幼苗进行丙二醛测定；
11.s4：取出不同组的枸杞幼苗进行过氧化氢测定；
12.s5：取出不同组的枸杞幼苗进行谷胱甘肽测定；
13.s6：取出不同组的枸杞幼苗进行可溶性糖含量的测定；
14.s7：根据测得的丙二醛、过氧化氢、谷胱甘肽、可溶性糖含量评价枸杞根腐病耐受性。
15.优选的，s1中，所述对照组的处理条件为在霍格兰营养液中培养一周和二周，所述实验组处理处理条件为霍格兰营养液加尖孢镰孢菌中培养一周和二周。
16.优选的，s3中，所述丙二醛测定具体为：
17.s31：吸取1ml提取液于0.1％tca(w/v)溶液于1.5ml ep管中，备用；
18.s32：将叶片充分研磨至粉末状，并称取100mg加入到上述提取液中，充分混匀，置于冰上；
19.s33：10000
×
g离心10分钟；
20.s34：吸取500μl上清于新的10ml离心管中，再加入1ml预冷的含有tba(0.25％,w/v)的tca(20％,w/v)溶液试剂，混匀。
21.s35：95℃孵育20min；
22.s36：于冰上冷却后10000
×
g离心5min，取上清，测吸光度a532和a600；
23.s37：计算单位质量鲜重叶片中的mda含量。
24.优选的，s4中，所述过氧化氢测定具体为：
25.s41：制备样品，液氮研磨至粉末状，称取约0.1g，加入1ml丙酮，混匀至匀浆；
26.s42：8000g、4℃离心10min，取上清，置冰上待测；
27.s43：加入试剂盒中的试剂二、试剂三、和试剂四，混匀，25℃水浴10min；
28.s44：4000g，25℃离心10min，弃上清，留沉淀；
29.s45：加入试剂四溶解沉淀后，室温静置5min，倒入比色皿中，测定415nm处吸光值a，对照管调零，计算δa＝a测定
‑
a对照，计算h2o2含量。
30.优选的，s45中，所述计算h2o2含量具体为按照样本质量计算，h2o2含量(μmol/g鲜重)＝[(δa
‑
0.0006)
÷
0.7488
×
v1]
÷
(w
×
v1
÷
v2)＝1.34
×
(δa
‑
0.0006)
÷
w，v1为加入反应体系中样本体积，1ml；v2为加入提取液体积，1ml；w为样本质量，g。
[0031]
优选的，s5中，所述谷胱甘肽含量测定具体为：
[0032]
s51：称取约0.1g组织，加入1ml试剂一(5％偏磷酸)进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测；
[0033]
s52：分光光度计预热30min，调节波长到412nm，空白管调零；
[0034]
s53：向上清液中加入试剂二(dtnb)，置于25℃水浴中保温30min；
[0035]
s54：空白管：取1ml玻璃比色皿，依次加入100μl蒸馏水，700μl试剂二，200μl试剂三，混匀静置2min后412nm吸光度处调零；
[0036]
s55：测定管：取1ml玻璃比色皿，依次加入100μl上清液，700μl试剂二，200μl试剂三，混匀静置2min后测定412nm吸光度，计算谷胱甘肽含量。
[0037]
优选的，所述计算谷胱甘肽含量具体为按样本鲜重计算，gsh(μmol/g鲜重)＝
△
a
÷
1.5
×
v样
÷
(v样
÷
v样总
×
w)＝0.667
×△
a
÷
w，v样总为上清液总体积，1ml；v样为加入反应体系中上清液体积，100μl＝0.1ml；w为样品质量，g。
[0038]
优选的，s6中，所述可溶性糖含量测定具体为：
[0039]
s61：提取可溶性糖；
[0040]
s62：分光光度计预热30min以上，调节波长至620nm；
[0041]
s63：调节水浴锅至95度；
[0042]
s64：加样表混匀，置95度水浴中10min，冷却至室温后，于620nm处，分别读取空白管和测定管吸光值，测定管调零，δa＝a测定管
‑
a空白管，计算可溶性糖含量。
[0043]
优选的，所述可溶性糖含量计算具体为按样本鲜重计算，可溶性糖(mg/g鲜重)＝[(δa+0.07)
÷
8.55
×
v1]
÷
(w
×
v1
÷
v2)＝1.17
×
(δa+0.07)
÷
w。v1为加入样本体积，0.2ml；v2为加入提取液体积，10ml；w为样本鲜重，g。
[0044]
优选的，所述s61中，所述提取可溶性糖具体为称取0.1～0.2g样本，加入1ml蒸馏水研磨成匀浆，倒入有盖离心管中，95℃水浴10min，冷却后，8000g，25℃离心10min，取上清液于10ml试管中，用蒸馏水定容至10ml，摇匀备用。
[0045]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0046]
本发明提供的枸杞品种根腐病耐受性的评价方法，将枸杞幼苗于水培箱培养，通过测定分析根系丙二醛、过氧化氢、谷胱甘肽、可溶性糖含量的测定这四个生理指标在实验组和对照组中的变化情况，可以反映不同枸杞品种对根腐病菌的抗性强弱，在应对枸杞抵抗根腐病危害方面具有应用前景，可以分析不同枸杞品种之间对根腐病菌抗性的差异，有利于为枸杞的抗逆育种工作提供更进一步的指导。
附图说明
[0047]
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0048]
图1为本发明枸杞根系丙二醛含量示意图；
[0049]
图2为本发明枸杞根系过氧化氢含量示意图；
[0050]
图3为本发明枸杞根系谷胱甘肽含量示意图；
[0051]
图4为本发明枸杞根系可溶性糖含量示意图。
具体实施方式
[0052]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
[0053]
请参阅图1
‑
4，本发明提供一种技术方案：一种评价枸杞根腐病耐受性的方法，包括以下步骤：
[0054]
s1：将枸杞幼苗于水培箱培养，分别做对照组处理和实验组处理，处理时间为一周和两周；
[0055]
s2：将处理后的枸杞幼苗取根系速冻于液氮中，保存于零下80℃备用；
[0056]
s3：取出不同组的枸杞幼苗进行丙二醛测定；
[0057]
s4：取出不同组的枸杞幼苗进行过氧化氢测定；
[0058]
s5：取出不同组的枸杞幼苗进行谷胱甘肽测定；
[0059]
s6：取出不同组的枸杞幼苗进行可溶性糖含量的测定；
[0060]
s7：根据测得的丙二醛、过氧化氢、谷胱甘肽、可溶性糖含量评价枸杞根腐病耐受性。
[0061]
丙二醛含量测定
[0062]
本发明选用宁杞1号、宁杞5号、宁杞7号和中国枸杞为实验材料，同样采用组织培养结合水培的实验方法，分别测定菌种处理一周及两周时间宁杞1号、宁杞5号、宁杞7号以及中国枸杞根系中丙二醛的含量变化。结果如图1所示，在处理1周的时候，根系中的丙二醛含量总体高于处理2周的时候，这可能因为到处理两周，枸杞幼苗已经开始自愈，其体内的丙二醛含量有所回落，但是宁杞5号在处理到两周的时候，其根系内的丙二醛含量依然居高不下。其次，观察处理一周的检测结果可见，用尖孢镰孢菌处理一周时间，在宁杞1号、宁杞5号、宁杞7号和中国枸杞根系中均可引起丙二醛含量的显著增多，但是宁杞5号中的增幅尤其明显。因此，宁杞5号幼苗的生长发育以及根系的生长对尖孢镰孢菌的耐受性相对较弱。
[0063]
丙二醛通常被用来指示脂类过氧化的程度。在高温条件下，1分子的丙二醛能够和2分子的硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,tba)在三氯乙酸(trichloroacetic acid,tca)的催化下发生亲核加成反应，生成在532nm有最大吸光度的红色产物(3,5,5
‑
三甲基恶唑
‑
2,4
‑
二酮)。测定步骤如下，第一步：吸取1ml提取液于0.1％tca(w/v)溶液于1.5ml ep管中，备用；第二步：将叶片充分研磨至粉末状，并称取100mg加入到上述提取液中，充分混匀，置于冰上；第三步：10000
×
g离心10分钟；第四步：吸取500μl上清于新的10ml离心管中，再加入1ml预冷的试剂(含有tba(0.25％,w/v)的tca(20％,w/v)溶液)，混匀；第五步：95℃孵育20min；第六步：于冰上冷却后10000
×
g离心5min，取上清，测吸光度a532和a600；第七步：计算单位质量鲜重叶片中的mda含量。
[0064]
过氧化氢含量测定
[0065]
植物在抗病反应中往往积累更过的过氧化氢，因此，项目组继而检测了尖孢镰孢菌分别处理一周和两周枸杞幼苗根系中的过氧化氢积累量。结果如图二所示，对照组和实验组根系的过氧化氢含量在两周时均低于一周取样。其次，处理两周时，宁杞1号、宁杞5号、宁杞7号和中国枸杞根系中的过氧化氢含量并未受尖孢镰孢菌处理出现显著差异。而处理一周时，处理组根系过氧化氢含量均高于对照组，虽然均没有达到显著性差异，但是可以观察到宁杞5号中的增幅明显高于宁杞1号、宁杞7号与中国枸杞。
[0066]
过氧化氢能够与硫酸钛生成黄色的过氧化钛复合物，在415nm有特征吸收。提前准备好丙酮60ml、浓盐酸10ml、研钵和冰备用。测定步骤如下：第一步：制备样品，液氮研磨至粉末状，称取约0.1g，加入1ml丙酮，混匀至匀浆；第二步：8000g、4℃离心10min，取上清，置冰上待测；第三步：加入试剂盒中的试剂二、试剂三、和试剂四，混匀，25℃水浴10min；第四步：4000g，25℃离心10min，弃上清，留沉淀；第五步：加入试剂四溶解沉淀后，室温静置5min，倒入比色皿中，测定415nm处吸光值a，对照管调零。计算δa＝a测定
‑
a对照。
[0067]
h2o2含量计算：
[0068]
按照样本质量计算
[0069]
h2o2含量(μmol/g鲜重)＝[(δa
‑
0.0006)
÷
0.7488
×
v1]
÷
(w
×
v1
÷
v2)＝1.34
×
(δa
‑
0.0006)
÷
w
[0070]
v1：加入反应体系中样本体积，1ml；
[0071]
v2：加入提取液体积，1ml；
[0072]
w：样本质量，g。
[0073]
枸杞根系谷胱甘肽含量测定
[0074]
植物在抗病反应中谷胱甘肽的含量会发生变化，以抵御环境胁迫带来的氧化损伤。因此，项目组继而检测了尖孢镰孢菌分别处理一周和两周枸杞幼苗根系中的谷胱甘肽的含量变化情况。结果如图三所示，宁杞1号和宁杞7号根系中的谷胱甘肽含量没有受尖孢镰孢菌影响发生显著变化。宁杞5号在处理一周的时候，其根系中的谷胱甘肽含量显著增多，而中国枸杞在尖孢镰孢菌处理一周和两周的时候，其根系中的谷胱甘肽含量均显著减少。
[0075]
实验原理：5，5
’‑
二硫代
‑
双
‑
(2
‑
硝基苯甲酸)(5，5
’‑
dithiobis
‑2‑
nitrobenoic acid，dtnb)与gsh反应生成复合物，在412nm处有特征吸收峰；其吸光度与gsh含量成正比。
[0076]
粗酶液提取：称取约0.1g组织，加入1ml试剂一(5％偏磷酸)进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。
[0077]
实验步骤：1.分光光度计预热30min，调节波长到412nm，空白管调零。2.向上清液中加入试剂二(dtnb)，置于25℃水浴中保温30min。3.空白管：取1ml玻璃比色皿，依次加入100μl蒸馏水，700μl试剂二，200μl试剂三，混匀静置2min后412nm吸光度处调零。4.测定管：取1ml玻璃比色皿，依次加入100μl上清液，700μl试剂二，200μl试剂三，混匀静置2min后测定412nm吸光度。gsh含量计算公式：按样本鲜重计算，gsh(μmol/g鲜重)＝
△
a
÷
1.5
×
v样
÷
(v样
÷
v样总
×
w)＝0.667
×△
a
÷
w；
[0078]
v样总：上清液总体积，1ml；
[0079]
v样：加入反应体系中上清液体积，100μl＝0.1ml；
[0080]
w：样品质量，g。
[0081]
可溶性糖含量测定
[0082]
植物在抗病反应中可溶性糖含量会发生变化以抵御环境胁迫。因此，项目组继而检测了尖孢镰孢菌分别处理一周和两周枸杞幼苗根系中的可溶性糖的含量变化情况。结果如图四所示，只有宁杞1号在尖孢镰孢菌处理两周的时候其根系中的可溶性糖含量显著减少，而宁杞5号、宁杞7号和中国枸杞的根系在尖孢镰孢菌处理一周的时候，可溶性糖含量显著增多，而在处理到两周的时候已经没有显著差异。
[0083]
实验原理：蒽酮比色法。可用于可溶性单糖、寡糖和多糖的含量测定，具有灵敏度高﹑简便快捷﹑适用于微量样品的测定等优点。
[0084]
样品中可溶性糖的提取：称取0.1～0.2g样本，加入1ml蒸馏水研磨成匀浆，倒入有盖离心管中，95℃水浴10min(盖紧，以防止水分散失)，冷却后，8000g，25℃离心10min，取上清液于10ml试管中，用蒸馏水定容至10ml，摇匀备用。
[0085]
实验步骤：1、分光光度计预热30min以上，调节波长至620nm。2、调节水浴锅至95度。3、加样表(在ep管中反应)混匀，置95度水浴中10min(盖紧，以防止水分散失)，冷却至室温后，于620nm处，分别读取空白管和测定管吸光值，测定管调零。δa＝a测定管
‑
a空白管。
[0086]
试剂(μl)空白管(μl)测定管(μl)
样本 200蒸馏水400200蒽酮试剂100100浓硫酸10001000
[0087]
可溶性糖含量计算：按样本鲜重计算，可溶性糖(mg/g鲜重)＝[(δa+0.07)
÷
8.55
×
v1]
÷
(w
×
v1
÷
v2)＝1.17
×
(δa+0.07)
÷
w。v1：加入样本体积，0.2ml；v2：加入提取液体积，10ml；w：样本鲜重，g。
[0088]
本发明提供的枸杞品种根腐病耐受性的评价方法，将枸杞幼苗于水培箱培养，分别做对照组处理和实验组处理(霍格兰营养液加，于不同条件下处理一周，取根系速冻于液氮中，保存于
‑
80℃冰箱备用，用于后续根系丙二醛、过氧化氢、谷胱甘肽、可溶性糖含量的测定。通过测定分析这四个生理指标在实验组和对照组中的变化情况，可以反映不同枸杞品种对根腐病菌的抗性强弱，对于枸杞的抗逆育种工作具有重要的指导意义，在应对枸杞抵抗根腐病危害方面具有应用前景，可以分析不同枸杞品种之间对根腐病菌抗性的差异，有利于为枸杞的抗逆育种工作提供更进一步的指导。
[0089]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0090]
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。