一种在循环肿瘤细胞中检测VEGFR2蛋白的金纳米杆抗体复合体及其制备方法与流程

本发明涉及体外诊断领域，具体涉及一种在循环肿瘤细胞中检测vegfr2蛋白的金纳米杆抗体复合体及其制备方法。

背景技术：

1、胃癌在中国的发病率和死亡率均居高不下。近年来发现vegfr2作为新型药物靶点在2014 年被fda批准用于晚期胃癌的治疗。在雷莫芦单抗(抗vegfr2单克隆抗体)研究中，通过 rainrow实验(二线治疗，雷莫芦单抗+紫杉醇vs顺铂+紫杉醇)，晚期胃癌的总生存期从7.4 个月上升至9.6个月。另一项regard实验(二线治疗，雷莫芦单药vs顺铂)表明，雷莫芦单抗单药使用与顺铂相比中位数总生存期从3.8个月上升至5.2个月。基于以上结果，fda批准雷莫卢单抗(ramucirumab)以单药或者联合用药形式作为转移性或进展性胃癌的二线治疗方案。一项晚期胃癌的一线临床实验表明，雷莫芦单抗联合氟尿嘧啶虽然没有提高总生存期，但无进展生存期有明显上升，且患者生存质量大幅度改善。目前雷莫芦单抗正在尝试用于曲妥珠单抗耐药后的治疗，雷莫卢单抗+纳武单抗也在进行临床实验。研究表明36％-40％的胃癌患者高表达vegfr2，除此之外，有研究表明vegfr2表达信息对胃癌的生存期预测至关重要。

2、本专利在原有专利(申请号201911282189.7)的基础上进行性能升级，研究发现原有的检测技术以vegfr2抗体作为检测试剂,检测灵敏度仍旧不足，仅能满足临床应用的最低要求 (判断阴性和阳性),因此需要一种性能增强的检测方法应用于细胞vegfr2检测。

3、理论上抗体性能增强的方法有两种：重新开发高性能抗体以及原有抗体改造。前者可能改变原有抗体的识别位点，这种改变会存在潜在的风险，即检测识别位点与药物攻击位点不一致，导致药物有脱靶的可能。因此抗体改造的实际临床意义更大。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于设计金纳米杆vegfr2荧光抗体复合体的合成方法，该复合体较常规抗体，在细胞识别方面由明显提升，为后续循环肿瘤细胞中vegfr2表达分类提供技术支撑，为vegfr2药物治疗方案的筛选提供依据。

2、本发明涉及体外诊断领域，特别循环肿瘤细胞中癌症标志物vegfr2检测领域，具体地说，涉及一种采用双重修饰的聚乙二醇分子将vegfr2抗体与金纳米杆连接，以增强原有vegfr2 抗体检测能力，最终将该方法应用于循环肿瘤细胞检测vegfr2表达。

3、一种在循环肿瘤细胞中检测vegfr2蛋白的金纳米杆抗体复合体，复合体由金纳米杆、荧光标记的vegfr2抗体和双重修饰的聚乙二醇分子由共价化学键连接而成，其示意结构为：

4、

5、其中为金纳米杆(简述为aunr)，为荧光标记抗体(简述为ab)，为荧光基团，为双重修饰的聚乙二醇分子(简述为peg)。

6、一种所述的金纳米杆vegfr2荧光抗体复合体的合成方法，以hs-(peg)n-cooh分子作为媒介，hs端以金硫键与金纳米杆aunr相连，通过离心去除多余的peg分子，之后将连接好的复合体aunr-peg与抗体ab以肽键相连，最终形成复合体aunr-peg-ab，合成具体路线图为：

7、

8、优选的，所述金纳米杆的规格为9-16nm直径×46-56nm长，负电，750-850nm最大吸收。

9、优选的，所述hs-(peg)n-cooh分子量为3-4kda。

10、优选的，所述抗体为vegfr2蛋白专一识别抗体，优选药用雷莫芦单克隆抗体。

11、优选的，荧光基团选自fam、hex、tet、vic、rox、cy5、cy3、joe、alex和cal等常用商业化荧光标记的任意一种。

12、所述的金纳米杆vegfr2荧光抗体复合体的合成方法，其具体合成步骤为：

13、s1：取1ml(含金纳米杆0.1mg)，加入0.2mg peg、0.02mg sds，摇床室温孵育过夜,之后将液体转移至透析袋，透析液选择纯水，每2小时换一次水，反复5次。

14、s2：将纯化好的aunr-peg溶液12,000×g离心1h，去掉上清液，加入1ml mes缓冲液，在加入0.5mg edc(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)、0.8mg nhs(n-hydroxysulfosuccinimide)，室温反应1h，12,000×离心30min，去掉上清之后加入1mlmes再次离心30min；收获的沉淀即为复合物。

15、一种所述的在循环肿瘤细胞中检测vegfr2蛋白表达的金纳米杆荧光抗体复合体的验证方法，为了测试合成材料对抗体检测灵敏度的增强作用，采用低浓度抗体进行验证，将最佳检测浓度5μg/ml进一步稀释为1μg/ml，结果发现对照组中(单纯抗体组)的检测效率大幅度降低，直至4小时才有较弱荧光出现，实验组中aunr-peg-ab含有ab为1μg/ml，结果发现在4h时荧光强度远超于ab组，且2小时已经有一定的检测能力。

16、与现有技术相比：本研究与传统的抗体检测方法相比，在ihc结果中表现为更高的灵敏度，对于vegfr2阳性组织而言，在vegfr2抗体识别有阳性区域时，金纳米杆vegfr2 荧光抗体复合体呈现更强的识别效果，而vegfr2识别阴性的样本区域，金纳米杆vegfr2 荧光抗体复合体同样没有识别而表现为阴性。对于vegfr2阴性表达样本而言，抗体与金纳米杆vegfr2荧光抗体复合体均没有任何识别。表明该金纳米杆vegfr2荧光抗体复合体在提升原有抗体灵敏度的同时保持了原有抗体的特异性。

技术特征：

1.一种在循环肿瘤细胞中检测vegfr2蛋白的金纳米杆抗体复合体，其特征在于：复合体由金纳米杆、荧光标记的vegfr2抗体和双重修饰的聚乙二醇分子由共价化学键连接而成，其示意结构为：

2.一种如权利要求1所述的金纳米杆vegfr2荧光抗体复合体的合成方法，其特征在于：以hs-(peg)n-cooh分子作为媒介，hs端以金硫键与金纳米杆aunr相连，通过离心去除多余的peg分子，之后将连接好的复合体aunr-peg与抗体ab以肽键相连，最终形成复合体aunr-peg-ab，合成具体路线图为：

3.如权利要求2所述的金纳米杆vegfr2荧光抗体复合体的合成方法，其特征在于：所述金纳米杆的规格为9-16nm直径×46-56nm长，负电，750-850nm最大吸收。

4.如权利要求2所述的金纳米杆vegfr2荧光抗体复合体的合成方法，其特征在于：所述hs-(peg)n-cooh分子量为3-4kda。

5.如权利要求2所述的金纳米杆vegfr2荧光抗体复合体的合成方法，其特征在于：所述抗体为vegfr2蛋白专一识别抗体，优选药用雷莫芦单克隆抗体。

6.如权利要求5所述的vegfr2荧光抗体，其特征在于：荧光基团选自fam、hex、tet、vic、rox、cy5、cy3、joe、alex和cal等常用商业化荧光标记的任意一种。

7.如权利要求2所述的金纳米杆vegfr2荧光抗体复合体的合成方法，其特征在于：其具体合成步骤为：

8.一种如权利要求1所述的在循环肿瘤细胞中检测vegfr2蛋白表达的金纳米杆荧光抗体复合体的验证方法，其特征在于：为了测试合成材料对抗体检测灵敏度的增强作用，采用低浓度抗体进行验证，将最佳检测浓度5μg/ml进一步稀释为1μg/ml，结果发现对照组中(单纯抗体组)的检测效率大幅度降低，直至4小时才有较弱荧光出现，实验组中aunr-peg-ab含有ab为1μg/ml，结果发现在4h时荧光强度远超于ab组，且2小时已经有一定的检测能力。

技术总结
本发明提供一种在循环肿瘤细胞中检测VEGFR2蛋白的金纳米杆抗体复合体及其制备方法，本发明涉及体外诊断领域，特别循环肿瘤细胞中癌症标志物VEGFR2检测领域，具体地说，涉及一种利用双重分子修饰的聚乙二醇将VEGFR2抗体与金纳米杆连接到一起，从而在细胞水平增强原有VEGFR2抗体检测能力，最终将该方法应用于循环肿瘤细胞检测平台，在鉴定循环肿瘤细胞的基础上检测VEGFR2表达信息。较常规VEGFR2检测抗体的方法而言，本发明的VEGFR2金纳米杆荧光抗体复合体具有更高的检测强度，同时保持了原有抗体的特异性。更高的检测强度，从而更加精准的对VEGFR2表达类型进行分类。

技术研发人员：范林洋
受保护的技术使用者：桐庐纳泰医学检验实验室有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13