纳米孔生物传感器及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物传感器，具体涉及一种纳米孔生物传感器及其制备方法和应用。

背景技术：

1、生物传感器可以对复杂的生物介质进行分析，不仅用于科学研究，还可用于化工和食品行业的工艺控制。此外，它还是医疗领域不可缺少的产品，可用于疾病的诊断、治疗和监控，制药和生物技术行业需要频繁甚至是不间断地分析生物介质。

2、近年来，以单分子纳米孔测序技术作为代表的第三代测序技术以超长读长、实时检测、可以直接读取修饰碱基、直接读取rna等优势在生命科学领域受到了广泛的关注。目前，纳米孔主要分为固态纳米孔和生物纳米孔，其中，构建生物纳米孔所需的蛋白主要由细胞表达，通过一定的纯化手段获得高纯度组装的孔蛋白。

3、因此，亟需开发一种稳定性高、易于制备的纳米孔生物传感器。

技术实现思路

1、本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供了一种纳米孔生物传感器及其制备方法和应用，该纳米孔生物传感器的制备方法简单，并且，该纳米孔生物传感器的稳定性好，可以实现聚合物、蛋白质或核酸的检测，应用前景广泛。

2、需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：

3、生物纳米孔具有成本较低、可大规模生产、可根据不同应用对蛋白进行不同突变改造、孔均一性良好等优势，其中，生物纳米孔多以跨膜蛋白组成，但膜蛋白一般分子量较大，疏水性高，在表达和纯化工艺方面有一定的复杂度和难度，并且，不同突变体可能需要开发不同的表达和纯化工艺，极大的限制了纳米孔的应用。β淀粉样蛋白是在阿兹海默症患者的脑内堆积而成的淀粉样斑块的蛋白，β-淀粉样蛋白多肽通常含有39-42个氨基酸，分子量在4-6kda，在三维结构中呈β型折叠的多肽，其肽段和突变片段用于研究代谢和条件功能。

4、发明人发现，β-淀粉样蛋白的氨基酸序列相对较短，合成简单，且易得到，通过将β淀粉样蛋白插入磷脂膜中形成生物纳米孔蛋白，可得到纳米孔生物传感器；并且，通过大量试验发现，相比于其他蛋白，选择β-淀粉样蛋白制得的纳米孔生物传感器重现性好，其含有纳米孔的膜结构稳定，且该制备方法操作简单，可实现规模化、商业化生产。发明人还发现，将蛋白、核酸和聚合物等大分子待测物加入至纳米孔生物传感器中，可使待测物顺利通过其纳米孔通道，并根据其阻滞电流的时间、振幅大小、频率、形状的不同，实现对待测物的检测，并且，该纳米孔生物传感器具有检测效率快、灵敏度高等优点。

5、因为，在本发明的一个方面，本发明提出了一种制备纳米孔生物传感器的方法。根据本发明的实施例，所述方法包含如下步骤：s1、将所述β淀粉样蛋白、磷脂和任选的助剂混合形成脂质体悬浊液，收集所述脂质体悬浊液中的脂质体；s2、提供电解池，所述电解池中间设置有含多孔结构的薄膜，以将所述电解池分为两个腔室，每个所述腔室内设置有电极，在所述薄膜上形成层膜；将所述脂质体加到所述层膜上，向两个腔室内的电极施加电压，以使将所述脂质体和层膜融合，形成纳米孔通道，得到所述纳米孔生物传感器。

6、发明人通过大量试验发现，通过选择β淀粉样蛋白，将其与磷脂和任选的助剂制备成脂质体，然后将脂质体与层膜进行融合，β淀粉样蛋白插入到层膜中形成生物纳米孔蛋白，可结合检测电流变化，构建纳米孔单分子生物传感器。当待测物通过β淀粉样蛋白时，根据阻滞电流的时间、振幅大小、频率、形状的不同来实现对待测物的检测。本发明得到的纳米孔生物传感器重现性好，其含有纳米孔的膜结构稳定性好，可使蛋白、核酸和聚合物等大分子待测物顺利通过纳米孔，并且，该制备方法操作简单，可实现规模化、商业化生产。

7、根据本发明的实施例，所述方法还可以进一步包含如下附加技术特征的至少之一：

8、根据本发明的实施例，所述助剂选自胆固醇、生育酚、卟啉、茄尼醇、单链脂肪酸、类固醇、疏水高分子材料中的至少之一。

9、根据本发明的实施例，基于所述脂质体悬浊液，所述助剂的添加量低于15体积％。

10、根据本发明的实施例，所述β淀粉样蛋白和磷脂的质量比为1：10-30。

11、根据本发明的实施例，所述β淀粉样蛋白具有seq id no：1～4任一项所示的氨基酸序列或者具有与其至少80％同源性的氨基酸序列。

12、根据本发明的实施例，所述脂质体悬浊液的制备还包含稳定液。

13、根据本发明的实施例，所述稳定液包含浓度为0.1-3m的kcl、浓度为200-300mm的蔗糖、浓度为200-300mm的4-羟乙基哌嗪乙磺酸，所述稳定液的ph值为7-8。

14、根据本发明的实施例，所述层膜选自磷脂膜或者高分子聚合物膜。

15、根据本发明的实施例，所述磷脂膜为磷脂双分子层膜。

16、根据本发明的实施例，所述多孔结构为微米级。

17、根据本发明的实施例，所述层膜的制备方法包含：将预处理液加入至所述薄膜上，分别于所述电解池的两个腔室中放入电极，然后将成膜液加入至所述薄膜上，以便在所述薄膜上形成所述层膜。

18、根据本发明的实施例，所述预处理液包含二植酰磷脂酰胆碱和烷溶液，其中，二植酰磷脂酰胆碱的浓度为1-3mg/ml。

19、根据本发明的实施例，所述成膜液包含二植酰磷脂酰胆碱和烷溶液，其中，二植酰磷脂酰胆碱的浓度为10-30mg/ml。

20、根据本发明的实施例，所述预处理液和所述成膜液的体积比为1:10-1000。

21、根据本发明的实施例，在所述成膜液加入前，于所述电解池内加入缓冲液。

22、根据本发明的实施例，所述缓冲液包含浓度为0.5-1m的kcl和浓度为10-300mm的4-羟乙基哌嗪乙磺酸，所述稳定液的ph值为7-9。

23、根据本发明的实施例，所述预处理液和所述缓冲液的体积比为1:1000-2000。

24、根据本发明的实施例，通过将所述脂质体加入到所述电解液的两个腔室的至少之一，以便使得脂质体与层膜进行融合。

25、在本发明的另一方面，本发明提出了一种纳米孔生物传感器。根据本发明的实施例，所述纳米孔生物传感器由上述的方法制备而成。由此，本发明得到的纳米孔生物传感器具有重现性好、结构稳定性高等优点。

26、在本发明的又一方面，本发明提出了上述的方法制备的纳米孔生物传感器或上述的纳米孔生物传感器在聚合物、蛋白或核酸检测中的用途。由此，当蛋白、核酸和聚合物等大分子待测物通过纳米孔生物传感器中的纳米孔通道时，根据其阻滞电流的时间、振幅大小、频率、形状的不同，可实现对待测物的监测，从而能够待测物进行检测，具有检测效率快、灵敏度高等优点。

27、根据本发明的实施例，所述聚合物、蛋白或核酸为肿瘤标志物。

28、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

技术特征：

1.一种制备纳米孔生物传感器的方法，其特征在于，包含如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脂质体悬浊液的制备还包含稳定液；

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述层膜选自磷脂膜或者高分子聚合物膜；

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述层膜的制备方法包含：

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在所述成膜液加入前，于所述电解池内加入缓冲液；

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，通过将所述脂质体加入到所述电解液的两个腔室的至少之一，以便使得脂质体与层膜进行融合。

7.一种纳米孔生物传感器，其特征在于，所述纳米孔生物传感器由权利要求1-6任一项所述的方法制备而成。

8.权利要求1-6任一项所述的方法制备的纳米孔生物传感器或权利要求7所述的纳米孔生物传感器在聚合物、蛋白或核酸检测中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述聚合物、蛋白或核酸为肿瘤标志物。

技术总结
本发明涉及一种纳米孔生物传感器及其制备方法和应用。该制备方法包含：将β淀粉样蛋白、磷脂和任选的助剂混合形成脂质体悬浊液，收集脂质体悬浊液中的脂质体，将电解池中间设置有含多孔结构的薄膜，电解池的两个腔室内均设置有电极，在薄膜上形成层膜，将脂质体加到层膜上，向两个腔室内的电极施加电压，使脂质体和层膜融合，形成纳米孔通道，得到所述纳米孔生物传感器；该纳米孔生物传感器在聚合物、蛋白或核酸检测中的用途。该制备方法操作简单，得到的纳米孔生物传感器具有重现性好、结构稳定性高等优点，可实现规模化、商业化生产；并且，得到的纳米孔生物传感器可对蛋白、核酸和聚合物等大分子进行检测，具有检测效率快、灵敏度高等优点。

技术研发人员：季州翔,曾涛,黎宇翔,董宇亮,吴蔚,章文蔚,徐讯
受保护的技术使用者：深圳华大生命科学研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13