一种用于检测体液中肿瘤细胞来源外泌体的纳米多孔金生物传感器及其制备方法和应用

本发明涉及生物传感器设计和肿瘤诊断，具体涉及一种用于检测体液中肿瘤细胞来源外泌体的纳米多孔金生物传感器的表面修饰方法。

背景技术：

1、癌症作为世界范围内的公共疑难疾病之一，严重威胁人类的生命健康。肿瘤细胞的早期检测对肿瘤的治疗具有重要意义，尽可能发现较早期的恶性肿瘤并进行治疗，可以获得较好的治疗效果。目前，主流的肿瘤组织检测方法有影像学检查、病理学检查、肿瘤标志物检测和基因检测等方法，这些方法大多需要大量样本或程序复杂，不利于肿瘤的早期诊断。

2、外泌体作为一种新兴的肿瘤标志物，他们广泛存在于生物的体液中。外泌体来源于细胞内溶酶体颗粒内陷形成的微囊泡，它们携带反映细胞特征的化学信息，包括核酸、蛋白质、脂质、氨基酸和代谢物，可用于癌症的早期诊断与术后检测。但是，患者的体液成分复杂，外泌体浓度较低，想要通过外泌体来获得可靠的信息仍然具有很大的挑战。传统的检测方法，如酶联免疫吸附试验(elisa)和westernblot分析，需要广泛的后标记过程和大量样本进行检测。鉴于这些方法操作繁琐或准确性有限的局限性，传统的外泌体分析方法在临床诊断中往往不切实际。

3、表面增强拉曼光谱(sers)是一种高灵敏度光谱分析方法，可以无损检测和识别特征分子的化学结构，具有检测单个生物细胞的能力，超高的灵敏度和对生物标志物快速识别的能力使其成为早期肿瘤诊断的一种理想方法。sers检测的重要基础是制备具有高灵敏度的衬底材料，金、银纳米颗粒在等离子体共振下会产生高效电磁增强作用，这种特性使其成为高灵敏度sers衬底的理想材料。然而，金、银纳米颗粒需要分散在溶液或胶体中，这给储存和使用带来诸多不便。纳米多孔金结构适合捕获外泌体，并且其表面等离子体共振效应显著，可以极大提高拉曼光谱的信号，因此其是一种用于外泌体检测的理想传感器。但是，人体血液中含有太多其他蛋白质、脂质等生物大分子和正常组织来源的外泌体，表面增强拉曼光谱信号会遭受来自众多杂质的干扰，从而无法准确确认血液中的信号来源。若不能特异性的分离血液中的肿瘤来源外泌体，仅仅凭借sers技术显然无法准确的实现肿瘤细胞检测。因此，通过在纳米多孔金表面连接特异性蛋白以精确捕获体液中的外泌体，可以实现在纳米多孔金传感器表面外泌体的富集和信号纯化。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明的目的在于提供一种可靠的表面修饰技术，以生产便于储存、使用并且具有特异性捕获体液中外泌体的高sers灵敏度生物芯片，以用于人体肿瘤的快速识别。

2、本发明通过以下技术方案实现：首先选择纳米孔尺寸与外泌体相匹配的纳米多孔金 (100～300nm)，然后在纳米片表面分步连接11-巯基十一烷酸(mua)，镍离子(ni2+)，组氨酸标记的cp05多肽(his-cp05)，最终得到具有特异性捕获外泌体能力的纳米多孔金 sers传感器。该传感器在人的体液中吸附外泌体后，经过拉曼测试得到对应的拉曼光谱，根据光谱信息可以识别出是否含有肿瘤来源的外泌体，从而判断人体是否患病。

3、具体来说，第一方面，本发明提供了一种纳米多孔金生物传感器，包括：纳米多孔金、链接在所述纳米多孔金上的11-巯基十一烷酸根、连接在11-巯基十一烷酸根的羧基末端的镍离子、以及通过所述镍离子连接的组氨酸标记的cp05多肽。

4、较佳地，所述纳米多孔金的孔径尺寸为100～300nm。

5、第二方面，本发明提供了一种上述纳米多孔金生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

6、(1)将纳米多孔金浸泡在11-巯基十一烷酸溶液中10～24小时，得到表面链接有11-巯基十一烷酸的纳米多孔金；

7、(2)将步骤(1)中得到的表面链接有11-巯基十一烷酸的纳米多孔金浸泡在naoh溶液中 3～8分钟进行质子交换，得到表面链接有11-巯基十一烷酸钠的纳米多孔金；

8、(3)将步骤(2)中得到的表面链接有11-巯基十一烷酸钠的纳米多孔金浸泡在镍盐溶液中 1～3小时进行质子交换，得到表面链接有11-巯基十一烷酸镍的纳米多孔金；

9、(4)向步骤(3)中得到的表面链接有11-巯基十一烷酸镍的纳米多孔金滴加组氨酸标记的 cp05多肽，通过镍离子与组氨酸的结合在纳米多孔金上链接组氨酸标记的cp05多肽；干燥、清洗后得到所述纳米多孔金生物传感器。

10、较佳地，所述步骤(1)中，11-巯基十一烷酸溶液的浓度为10～100mmol/l，溶剂为酒精。

11、较佳地，所述步骤(2)中，naoh溶液的浓度为0.5～2mmol/l。

12、较佳地，所述步骤(3)中，镍盐溶液中的镍离子浓度为0.1～1mol/l。

13、较佳地，所述步骤(4)中，组氨酸标记的cp05多肽的浓度为0.01～3mg/ml。

14、第三方面，本发明还提供了一种上述纳米多孔金生物传感器的应用，所述纳米多孔金生物传感器用于sers基底，通过sers的方法检测体液中肿瘤细胞来源外泌体。

15、纳米多孔金表面链接组氨酸标记的cp05多肽时需要保持弱碱性环境，修饰后的纳米多孔金传感器用磷酸盐缓冲盐溶液(pbs缓冲液)冲洗以去除多余的多肽。修饰后的纳米多孔金传感器用于血液中外泌体捕获，多孔金在体液中吸附的时间为5～15min，在体液中吸附外泌体之后，用pbs缓冲液冲洗以去除体液中的杂质干扰。

16、有益效果

17、(1)本发明的表面修饰方法稳定可靠，功能基团与多孔金结合牢固不易脱落；

18、(2)本发明制备的纳米多孔金传感器可以精确捕获体液中的外泌体，实现外泌体的富集，排除体液中杂质信号的干扰；

19、(3)本发明制备的纳米多孔金传感器可以直接检测体液中的外泌体，通过拉曼光谱分析外泌体的来源，不需要任何间接标记物。

技术特征：

1.一种纳米多孔金生物传感器，其特征在于，所述纳米多孔金生物传感器包括：纳米多孔金、链接在所述纳米多孔金上的11-巯基十一烷酸根、连接在11-巯基十一烷酸根的羧基末端的镍离子、以及通过所述镍离子连接的组氨酸标记的cp05多肽。

2.根据权利要求1所述的纳米多孔金生物传感器，其特征在于，所述纳米多孔金的孔径尺寸为100～300nm。

3.一种权利要求1或2所述的纳米多孔金生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，11-巯基十一烷酸溶液的浓度为10～100 mmol/l，溶剂为酒精。

5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，naoh溶液的浓度为0.5～2 mmol/l。

6.根据权利要求3至5中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，镍盐溶液中的镍离子浓度为0.1～1 mol/l。

7.根据权利要求3至6中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中，组氨酸标记的cp05多肽的浓度为0.01～3 mg/ml。

8.一种权利要求1或2所述的纳米多孔金生物传感器的应用，其特征在于，所述纳米多孔金生物传感器用于表面增强拉曼光谱sers基底，通过sers的方法检测体液中肿瘤细胞来源外泌体。

技术总结
本发明涉及一种用于检测体液中肿瘤细胞来源外泌体的纳米多孔金生物传感器及其制备方法和应用，所述纳米多孔金生物传感器包括：纳米多孔金、链接在所述纳米多孔金上的11‑巯基十一烷酸根、连接在11‑巯基十一烷酸根的羧基末端的镍离子、以及通过所述镍离子连接的组氨酸标记的CP05多肽。

技术研发人员：杨勇,林成龙,彭宇思,李妍妍,姚秀敏,黄政仁
受保护的技术使用者：中国科学院上海硅酸盐研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13