一种分离人外周血白细胞并检测活性氧的方法

本发明涉及一种分离人外周血白细胞并检测活性氧的方法，属于体外分子荧光探针检测领域。

背景技术：

1、心脑血管疾病是威胁人类健康的重要疾病，发病率逐年增高，发病年龄日趋年轻化。心脑血管疾病也是导致我国居民死亡的首要原因，已成为我国目前最为突出的公共卫生问题之一。在心脑血管疾病中，患病率最高的冠心病、脑卒中和外周血管病变等疾病的主要原因是动脉粥样硬化。

2、目前针对动脉粥样硬化的诊断主要依靠传统影像学，对于早期和极早期动脉粥样硬化斑块，传统影像学诊断率低。在动脉粥样硬化发生机制中，活性氧介导的氧化应激及其后续的慢性炎症是目前公认的动脉粥样硬化主要始动机制，且白细胞特别是巨噬细胞的脂质代谢紊乱进而引发的活性氧水平异常在动脉粥样硬化发生发展中起到关键作用。但目前尚无与动脉粥样硬化的氧化应激特征有关的文献和液体活检方法。此外，目前对于全血白细胞分离的方法中尚缺少简单易行，高产低损，快速高效的方案，为实现动脉粥样硬化斑块活性氧水平的早期和极早期检测，需要一种白细胞的快速高效的分离方式。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种人外周血白细胞分离液。

2、本发明的另一目的在于提供一种分离人外周血白细胞并检测活性氧的方法。

3、本发明的目的可通过以下技术方案实现：

4、一种人外周血白细胞分离液,所述的白细胞分离液为羟乙基淀粉和甲基纤维素溶于0.9％氯化钠注射液所得溶液,其中羟乙基淀粉的质量体积百分比为0.4-0.55g/100ml,甲基纤维素的质量体积百分比为0.08-0.12g/100ml。

5、作为本发明的一种优选，所述的人外周血白细胞分离液中羟乙基淀粉的质量体积百分比为0.50g/100ml,甲基纤维素的质量体积百分比为0.10g/100ml。

6、作为本发明进一步优选，所述的人外周血白细胞分离液通过以下方法制备得到：使用精密天平称取配方量的羟乙基淀粉和甲基纤维素粉末，加入0.9％氯化钠注射液定容至50ml，经0.25μm滤膜过滤除菌后使用。

7、本发明所述的人外周血白细胞分离液在分离人外周血白细胞中的应用。

8、一种分离人外周血白细胞并检测活性氧的方法，全程常温进行如下步骤：

9、(1)样本白细胞的分离与纯化：将本发明所述的白细胞分离液加入采集的人外周静脉血中，混匀后离心，得到上层白细胞上清，用hank's平衡盐溶液洗涤、纯化白细胞；

10、(2)活性氧荧光染色：用含有dcfh-da探针的缓冲液重悬细胞，避光染色孵25-30分钟，全黑96孔酶标板每孔加入100μl细胞悬液，并做6个重复孔，使用酶标仪检测各孔荧光强度并取得重复孔均值得到平均荧光强度值；

11、(3)细胞定量及荧光强度校准：吸取洗涤后的白细胞悬液，加入countstar细胞计数板并上机计数，多次计数取得细胞数均值后，将步骤(3)中得到的平均荧光强度值比上细胞数，获得经细胞数量归一校准后的荧光强度值，细胞数量归一校准后的荧光强度值反映白细胞活性氧水平的高低。

12、作为本发明的一种优选，步骤(1)中使用edta包被的负压抗凝管收集人外周静脉血，并轻柔地上下颠倒血样约8次。

13、作为本发明的一种优选，步骤(1)中白细胞分离液与人外周静脉血体积比为2：1，将白细胞分离液沿管壁缓慢加入，轻柔上下颠倒混匀8次，无需静置样本，立即使用水平转子离心机，在23-25℃下，100g离心10分钟，离心后用移液器收集上层白细胞上清于另一15ml无菌离心管中，加入hbss并轻柔吹打混匀，在23-25℃条件下，使用水平转子离心机，300g离心5min，离心完成后倾倒弃去上层液体，离心管底部的白色沉淀即为白细胞，再次加入hbss，使用移液器重悬洗涤白细胞并轻柔吹打混匀，在23-25℃条件下，使用水平转子离心机，300g离心5min，离心后倾倒弃去上清，最后一步洗涤离心前的白细胞悬液，吸取少量用于白细胞计数定量。

14、作为本发明的一种优选，步骤(2)中含探针缓冲液的dcfh-da探针浓度为20μm。使用酶标仪于激发光485/20nm，发射光528/20nm，增益80的条件下检测酶标板孔间荧光强度。

15、本发明的有益成果：本

16、发明优化了目前全血白细胞提取液及提取方法，采用本发明分离液能够快速无损地分离的人外周血白细胞，并且相较于传统的样本白细胞分离液，采用本发明可获得高活力、高纯度的白细胞。此外，利用本发明外周血白细胞分离和活性氧检测方法，其能快速测定分离纯化后的白细胞的活性氧水平，使用本发明方法对健康人和动脉粥样硬化患者的外周血白细胞进行活性氧的检测，能够判断不同人群白细胞活性氧水平的差异，为实现冠状动脉粥样硬化极早期的辅助诊断提供实验技术方案和理论依据。

技术特征：

1.一种人外周血白细胞分离液,其特征在于所述的白细胞分离液为羟乙基淀粉和甲基纤维素溶于0.9％氯化钠注射液所得溶液,其中羟乙基淀粉的质量体积百分比为0.4-0.55g/100ml,甲基纤维素的质量体积百分比为0.08-0.12g/100ml。

2.根据权利要求1所述的人外周血白细胞分离液,其特征在于所述的人外周血白细胞分离液中羟乙基淀粉的质量体积百分比为0.50g/100ml,甲基纤维素的质量体积百分比为0.10g/100ml。

3.根据权利要求1或2所述的人外周血白细胞分离液,其特征在于所述的人外周血白细胞分离液通过以下方法制备得到：使用精密天平称取配方量的羟乙基淀粉和甲基纤维素粉末，加入0.9％氯化钠注射液定容至50ml，经0.25μm滤膜过滤除菌后使用。

4.权利要求1或2所述的人外周血白细胞分离液在分离人外周血白细胞中的应用。

5.一种分离人外周血白细胞并检测活性氧的方法，其特征在于，全程常温进行如下步骤：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中使用edta包被的负压抗凝管收集人外周静脉血，并轻柔地上下颠倒血样约8次。

7.根据权利要求1所述的人外周血白细胞分离和活性氧检测方法，其特征在于，步骤(1)中白细胞分离液与人外周静脉血体积比为2：1，将白细胞分离液沿管壁缓慢加入，轻柔上下颠倒混匀8次，无需静置样本，立即使用水平转子离心机，在23-25℃下，100g离心10分钟，离心后用移液器收集上层白细胞上清于另一15ml无菌离心管中，加入hbss并轻柔吹打混匀，在23-25℃条件下，使用水平转子离心机，300g离心5min，离心完成后倾倒弃去上层液体，离心管底部的白色沉淀即为白细胞，再次加入hbss，使用移液器重悬洗涤白细胞并轻柔吹打混匀，在23-25℃条件下，使用水平转子离心机，300g离心5min，离心后倾倒弃去上清，最后一步洗涤离心前的白细胞悬液，吸取少量用于白细胞计数定量。

8.根据权利要求5所述的人外周血白细胞分离和活性氧检测方法，其特征在于，步骤(2)中含探针缓冲液的dcfh-da探针浓度为20μm。使用酶标仪于激发光485/20nm，发射光528/20nm，增益80的条件下检测酶标板孔间荧光强度。

技术总结
本发明公开了一种分离人外周血白细胞并检测活性氧的方法。所述的白细胞分离液为羟乙基淀粉和甲基纤维素溶于0.9％氯化钠注射液所得溶液。一种人外周血白细胞分离和活性氧检测方法，包括利用本发明白细胞分离液进行样本白细胞的分离与纯化、活性氧检测探针染色、荧光强度测定与校正三步。采用本发明能够快速无损地分离人外周血白细胞，并且相较于传统的样本白细胞分离液，采用本发明可获得高活力、高纯度的白细胞。进一步，采用本发明能够测定人外周血白细胞的活性氧水平，从而依此评估正常人或者动脉粥样硬化病人外周血氧化应激水平，为临床动脉粥样硬化早期诊断和治疗提供了一种新的重要评估指标。

技术研发人员：孙伟,舒环宇,李禄,赵云晰
受保护的技术使用者：南京医科大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13