粗壮女贞的指纹图谱构建方法与高分辨质谱成分基础鉴定的构建方法及其应用与流程

本发明涉及中药鉴别和药物成分基础研究领域，特别是涉及一种粗壮女贞的指纹图谱构建方法与高分辨质谱成分基础鉴定的构建方法及其应用。

背景技术：

1、苦丁茶在中国是仅次于茶叶的一大类传统代茶饮料的植物的总称，已有2000年以上的饮用和药用历史，誉为“益寿茶”、“减肥茶”和“绿色金子”。其中以粗壮女贞(ligustrumrobustum subsp.chinense p.s.green)为代表的木樨科苦丁茶和以苦丁茶冬青(ilexkudingcha c.j.tseng)为代表的冬青科苦丁茶已得到大规模的种植和生产化，产生了较大的经济价值和社会收益，开发前景较好。然而目前苦丁茶的市场应用具有盲目性，缺乏统一的质量控制体系，亟需针对市场主流品种苦丁茶建立系统的质量控制研究，以推动其基源的规范化应用和阐明其药效物质基础。

2、粗壮女贞为木樨科女贞属植物粗壮女贞(ligustrum robustum subsp.chinensep.s.green)的成熟叶，在中国四川、贵州和云南等西南地区被广泛用作苦丁茶，是一种传统的药食同源民族药。研究表明苯丙素苷类成分是粗壮女贞的主要药效活性物质。现代药理学证明，粗壮女贞的苯丙素苷类成分具有降酶保肝、抗甲型h1n1流感、抑制甘油三酯合成和促进胆固醇分解代谢、抗氧化应激、抗肿瘤和抗炎等生理活性作用，是一种具有良好开发潜力的药材。2020年版《中国药典》未收录粗壮女贞品种，且现行的四川省和贵州省中药材标准的质量控制项仅限于显微和薄层鉴别，缺乏能够体现药材内在品质的含量测定指标。近年来，粗壮女贞的研究主要集中在营养评价、化学成分分离纯化和药理活性等方面，但对其整体成分基础却未见系统性报道。

3、指纹图谱技术是一种常用于表征中药化学成分整体性的质量评价方法，且可以应用于基源鉴别的质量控制，已被国内外广泛认可。然而，目前关于粗壮女贞指纹图谱的研究很少，且已有的指纹图谱研究分离度和不对成度较差，整体谱图质量效果不高，难重现。

技术实现思路

1、基于此，本发明提供了一种粗壮女贞的指纹图谱构建方法，其获得的信息全面、稳定、分离效果好且专属性强，为粗壮女贞药材的质量控制提供了快速、有效的评价手段。

2、本发明通过如下技术方案实现。

3、一种粗壮女贞的指纹图谱构建方法，包括如下步骤：

4、取紫茎女贞苷b、紫茎女贞苷c、粗壮女贞苷n、毛蕊花糖苷和异类叶升麻苷对照品，制备混合对照品溶液；

5、取粗壮女贞样品，与质量分数为45％～55％的甲醇混合，超声提取，然后过滤，取滤液，制备供试品溶液；

6、将所述混合对照品溶液与所述供试品溶液分别进行超高效液相色谱测定；

7、其中，所述超高效液相色谱采用的条件包括：流动相a为甲醇，流动相b为体积分数为0.15％～0.25％的磷酸水溶液。

8、在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱采用的条件包括：采用梯度洗脱方式；所述梯度洗脱方式为：0min～10min，流动相a的体积百分数为30％；10min～26min，流动相a的体积百分数从30％变化至36％；26min～33min，流动相a的体积百分数从36％变化至41％；33min～37min，流动相a的体积百分数从41％变化至48％；37min～40min，流动相a的体积百分数从48％变化至52％；40min～45min，流动相a的体积百分数从52％变化至62％；45min～63min，流动相a的体积百分数从62％变化至65％。

9、在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱采用的流速为0.20ml/min～0.30ml/min。

10、在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱采用的柱温为25℃～35℃。

11、在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱采用的检测波长为326nm±10nm。

12、在其中一个实施例中，所述超高效液相色谱采用的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱。

13、在其中一个实施例中，所述十八烷基硅烷键合硅胶柱的尺寸包括：柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm。

14、在其中一个实施例中，制备对照品溶液包括如下步骤：

15、将紫茎女贞苷b、紫茎女贞苷c、粗壮女贞苷n、毛蕊花糖苷、异类叶升麻苷对照品与甲醇混合。

16、在其中一个实施例中，超声提取的条件包括：功率为400w～450w；时间为15min～45min。

17、本发明还提供一种如上所述的粗壮女贞的指纹图谱构建方法所构建获得的指纹图谱在鉴别粗壮女贞与苦丁茶冬青中的应用。

18、本发明还提供一种粗壮女贞的高分辨质谱成分基础鉴定的构建方法，包括如下步骤：

19、取粗壮女贞样品，与质量分数为45％～55％的甲醇混合，超声提取，然后过滤，取滤液，制备供试品溶液；

20、将所述供试品溶液进行超高效液相色谱与质谱联用测定；

21、其中，所述超高效液相色谱采用的条件与如上所述的超高效液相色谱采用的条件一致。

22、在其中一个实施例中，所述质谱采用正离子模式和/或负离子模式；

23、所述正离子模式中，离子源为加热电喷雾离子源，喷雾电压为+3kv，辅助气加热器温度为350℃，毛细管温度为350℃，鞘气流速为35arb，辅助气流速为12arb；一级质谱采用全扫描模式，分辨率为70000，自动增益控制目标为1e6，离子的采集范围为120m/z～1000m/z；二级质谱采用数据依赖扫描模式，分辨率为17500，自动增益控制目标为5e4；碰撞解离方式为碰撞诱导解离，二级碰撞能量为+40ev；

24、所述负离子模式中，离子源为加热电喷雾离子源，喷雾电压为-3.2kv，辅助气加热器温度为350℃，毛细管温度为350℃，鞘气流速为35arb，辅助气流速为12arb；一级质谱采用全扫描模式，分辨率为70000，自动增益控制目标为1e6，离子的采集范围为120m/z～1000m/z；二级质谱采用数据依赖扫描模式，分辨率为17500，自动增益控制目标为5e4；碰撞解离方式为碰撞诱导解离，二级碰撞能量为-20ev。

25、与现有技术相比较，本发明所述的粗壮女贞的指纹图谱构建方法具有如下有益效果：

26、本发明所述的粗壮女贞的指纹图谱构建方法采用超高效液相色谱技术，限定提取溶剂为45％～55％的甲醇、提取方法为超声提取，并限定流动相为甲醇与体积分数为0.15％～0.25％的磷酸水溶液，最终所获得的图谱分离效果好，所有主峰均处于基线分离状态，纯度高，且能够充分反映绝大部分活性成分的化学信息，展示了粗壮女贞药材的化学成分特征，可以直接应用于粗壮女贞药材的定性和定量控制。

技术特征：

1.一种粗壮女贞的指纹图谱构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的粗壮女贞的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述超高效液相色谱采用的条件包括：采用梯度洗脱方式；所述梯度洗脱方式为：0min～10min，流动相a的体积百分数为30％；10min～26min，流动相a的体积百分数从30％变化至36％；26min～33min，流动相a的体积百分数从36％变化至41％；33min～37min，流动相a的体积百分数从41％变化至48％；37min～40min，流动相a的体积百分数从48％变化至52％；40min～45min，流动相a的体积百分数从52％变化至62％；45min～63min，流动相a的体积百分数从62％变化至65％。

3.根据权利要求1所述的粗壮女贞的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述超高效液相色谱采用的流速为0.20ml/min～0.30ml/min。

4.根据权利要求1所述的粗壮女贞的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述超高效液相色谱采用的柱温为25℃～35℃。

5.根据权利要求1所述的粗壮女贞的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述超高效液相色谱采用的检测波长为326nm±10nm。

6.根据权利要求1所述的粗壮女贞的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述超高效液相色谱采用的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱。

7.根据权利要求6所述的粗壮女贞的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述十八烷基硅烷键合硅胶柱的尺寸包括：柱长为150mm，内径为2.1mm，粒径为1.7μm。

8.根据权利要求1～7任一项所述的粗壮女贞的指纹图谱构建方法，其特征在于，制备对照品溶液包括如下步骤：

9.根据权利要求1～7任一项所述的粗壮女贞的指纹图谱构建方法，其特征在于，超声提取的条件包括：功率为400w～450w；时间为15min～45min。

10.权利要求1～9任一项所述的粗壮女贞的指纹图谱构建方法所构建获得的指纹图谱在鉴别粗壮女贞与苦丁茶冬青中的应用。

11.一种粗壮女贞的高分辨质谱成分基础鉴定的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

12.根据权利要求11所述的粗壮女贞的高分辨质谱成分基础鉴定的构建方法，其特征在于，所述质谱采用正离子模式和/或负离子模式；

技术总结
本发明提供了一种粗壮女贞的指纹图谱构建方法，包括如下步骤：取紫茎女贞苷B、紫茎女贞苷C、粗壮女贞苷N、毛蕊花糖苷和异类叶升麻苷对照品，制备混合对照品溶液；取粗壮女贞样品，与质量分数为45％～55％的甲醇混合，超声提取，然后过滤，取滤液，制备供试品溶液；将混合对照品溶液与供试品溶液分别进行超高效液相色谱测定。本发明还提供了一种粗壮女贞的高分辨质谱成分基础鉴定的构建方法，包括如下步骤：取粗壮女贞样品，与质量分数为45％～55％的甲醇混合，超声提取，然后过滤，取滤液，制备供试品溶液；将供试品溶液进行超高效液相色谱与质谱联用测定。本发明提供的方法获得的信息全面、稳定、分离效果好且专属性强。

技术研发人员：罗文汇,马懿飞,凌志洲,周湘媛,曹斯琼,李振雨,彭娇,魏梅,孙冬梅,陈向东
受保护的技术使用者：广东一方制药有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15