一种检测非洲猪瘟病毒抗体的ELISA检测试剂盒以及proteinL的应用

本申请涉及免疫检测，尤其涉及一种检测非洲猪瘟病毒抗体的elisa检测试剂盒以及proteinl的应用。

背景技术：

1、非洲猪瘟(african swine fever，asf)是由非洲猪瘟病毒(african swinefevervirus，asfv)感染引起猪的一种急性、烈性传染病。该病在临床上可引起猪的高热、网状内皮系统出血、可视黏膜发红等症状，强毒株感染猪病程短，死亡率高达100％。

2、非洲猪瘟病毒是一种有囊膜的双链dna病毒，具有复杂的多层结构。其5层结构由内到外依次为类核、核壳、内膜、衣壳和外囊膜。非洲猪瘟病毒可编码200多种蛋白质，其中衣壳的主要成分p72蛋白约占非洲猪瘟病毒总质量的33％。此前，已有报道基于p30、p54蛋白开发的间接elisa抗体检测试剂盒。其中，由于p72全长三聚体蛋白制备困难，市售基于p72蛋白的间接elisa试剂盒均应用p72截短体，尚无应用p72全长三聚体蛋白制备检测试剂盒的报道。此前，我们已成功在酿酒酵母表达系统中大量表达p72三聚体蛋白，且其结构与天然结构完全相同(专利号：202110522777.4)。

3、oie推荐的非洲猪瘟病毒诊断技术包括病原学检测和血清学试验。其中，elisa是oie规定的国际贸易检验方法。基于p72全长三聚体蛋白的间接elisa方法具有特异性高、敏感性强的优势，同时elisa多样品、高通量检测的特点也适于在大规模养殖场中推行。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测非洲猪瘟病毒抗体的elisa试剂盒，用于非洲猪瘟病毒抗体检测时具备较高的特异性、灵敏性和准确性；

2、本发明的另外一个目的在于提供protein l在制备检测非洲猪瘟病毒抗体的elisa试剂盒中的应用，如制备酶结合物。

3、为了解决上述技术问题/达到上述目的或者至少部分地解决上述技术问题/达到上述目的，本发明提供了一种检测非洲猪瘟病毒抗体的elisa检测试剂盒，包括包被有非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72三聚体的酶标板和protein l酶结合物。

4、本发明在前期p72全长三聚体蛋白已有成果基础上进行非洲猪瘟病毒抗体elisa检测产品的研制，经过本发明研究发现，以非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72三聚体作为包被抗原并结合protein l酶结合物，按照间接elisa检测，灵敏度可以检测到64000倍稀释阳性血清，而常规的以p72无序折叠单体蛋白、p54蛋白和p30蛋白为包被抗原的灵敏度仅可以检测到16000倍、8000倍和8000倍稀释阳性血清；

5、而且，在相同的p72三聚体包被抗原前提下，使用protein l/a/g酶结合物和羊抗猪igg酶结合物进行检测，结果显示使用protein l酶结合物可以检测到64000倍稀释阳性血清，其他三种酶结合物均只能检测到32000倍稀释阳性血清。鉴于上述的优异技术效果，本发明提出了protein l在制备检测非洲猪瘟病毒抗体的elisa检测试剂盒中的应用，优选为protein l和非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72三聚体联合在制备检测非洲猪瘟病毒抗体的elisa检测试剂盒中的应用。在本发明具体实施方式中，所述protein l用于制备试剂盒中的酶结合物。

6、本发明试剂盒中所述非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72三聚体通过利用crispr-cas9技术将非洲猪瘟病毒特异性p72蛋白基因插入酿酒酵母by4743基因组中，实现p72三聚体蛋白高拷贝表达，相关内容已经全部记载在cn202110522777.4中，其全部记载同样可以作为本发明所记载的内容。本发明按照cn202110522777.4的制备方法制备获得无需依靠辅助蛋白b602l即可正确组装形成三聚体构型的重组p72蛋白。所述非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72的序列如seq id no:1所示或在seq id no:1所示蛋白序列上添加蛋白标签序列。在本发明具体实施方式中，所述蛋白标签为twin-strep-tag，融合在p72蛋白的n端或者c端。

7、试剂盒中所述protein l酶结合物为酶标记的protein l；作为优选，所述酶为辣根过氧化物酶，所述protein l酶结合物工作浓度为1:5000～10000，在本发明具体实施方式中，工作浓度为1:8000。

8、同时，本发明所述试剂盒中还包括如下组分中的任意一种或两种以上：

9、酶结合物稀释液、洗涤液、底物、样本稀释液、终止液、阴性对照和阳性对照。其中，所述底物根据所选择的酶对应选择，在本发明具体实施方式中，所述酶选择为辣根过氧化物酶，则底物选择为底物a液3,3′,5,5′-四甲基联苯胺溶液，以及底物b液过氧化物溶液。

10、作为优选，所述酶结合物稀释液为含有bsa的pbst；在本发明具体实施方式中，所述酶结合物稀释液为含有1％bsa的pbst。

11、作为优选，所述样本稀释液为含有胎牛血清(fbs)的pbst；在本发明具体实施方式中，所述样本稀释液为含1％胎牛血清的pbst。

12、作为优选，所述阳性对照为免疫非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72三聚体的正常猪血清，所述阴性对照为未免疫非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72三聚体的正常猪血清。

13、采用本发明试剂盒分别检测已验证的非洲猪瘟病毒抗体阳性血清、猪圆环病毒抗体阳性血清、猪蓝耳病毒抗体阳性血清、猪伪狂犬病毒抗体阳性血清、猪瘟病毒抗体阳性血清和非洲猪瘟病毒抗体阴性血清，结果显示所述抗原用于检测非洲猪瘟病毒抗体时具有良好的特异性。

14、此外，取本发明同一批号间接elisa试剂盒对92份临床待测血清样本分别进行检测，观察结果并与国际通用试剂盒id vet间接elisa试剂盒检测数据比较。id vet间接elisa试剂盒检测数据显示：在92份血清样品中，57份为阳性，35份为阴性；而本发明的阳性符合数60份，阴性符合数32份，阳性符合率100％(57/57)，阴性符合率91.4％(32/35)，总符合率96.7％(89/92)。表明所述抗原用于检测非洲猪瘟病毒抗体时具有良好的准确性。

15、由以上技术方案可知，本发明应用protein l酶结合物和非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72三聚体包被抗原，两者联合制备检测非洲猪瘟病毒抗体的elisa检测试剂盒，所述试剂盒能够快速而特异地检测血清中非洲猪瘟病毒抗体，且反应灵敏性极高，其操作简便、成本低廉、反应结果稳定，适于在大规模养殖中对猪群进行非洲猪瘟的监测、排查工作，易于大范围推广应用。

技术特征：

1.protein l和非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72三聚体在制备检测非洲猪瘟病毒抗体的试剂盒中的应用，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72三聚体的序列如seq id no:1所示或在其基础上添加标签序列。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述protein l用于制备试剂盒中的酶结合物。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述protein l酶结合物为protein l辣根过氧化物酶结合物。

4.根据权利要求1～3任意一项所述应用，其特征在于，所述试剂盒还包括酶结合物稀释液、洗涤液、底物、样本稀释液、终止液、阴性对照和阳性对照中的任意一种或两种以上。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述酶结合物稀释液为含有bsa的pbst。

6.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述样本稀释液为含有胎牛血清的pbst。

7.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述阳性对照为免疫非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72三聚体的正常猪血清。

8.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述阴性对照为未免疫非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72三聚体的正常猪血清。

9.一种检测非洲猪瘟病毒抗体的elisa检测试剂盒，其特征在于，包括包被有非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72三聚体的酶标板和protein l酶结合物；所述非洲猪瘟病毒衣壳蛋白p72三聚体的序列如seq id no:1所示或在其基础上添加标签序列。

10.根据权利要求9所述试剂盒，其特征在于，所述protein l酶结合物为protein l辣根过氧化物酶结合物。

技术总结
本发明涉及免疫检测技术领域，公开了一种检测非洲猪瘟病毒抗体的ELISA检测试剂盒以及proteinL的应用。本发明应用proteinL和非洲猪瘟病毒衣壳蛋白P72三聚体联合制备检测非洲猪瘟病毒抗体的ELISA检测试剂盒，所述试剂盒能够快速而特异地检测血清中非洲猪瘟病毒抗体，且反应灵敏性极高，其操作简便、成本低廉、反应结果稳定，适于在大规模养殖中对猪群进行非洲猪瘟的监测、排查工作，易于大范围推广应用。

技术研发人员：孟赓,步志高,赵东明,朱文壮,张跃平,刘文兴,刘任强
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12