一种针对食品中真菌毒素的非靶向筛查方法

本发明建立一种基于超高效液相色谱-高分辨质谱联用平台，提取真菌毒素质谱特征并在食品基质中进行非靶向筛查的分析方法，属于分析检测领域和食品安全领域。

背景技术：

1、真菌毒素是真菌的二级代谢产物，具有低分子量和高累积性，一旦摄入会对人体健康造成极大危害。目前已确定结构的真菌毒素有400多种，常见的真菌毒素包括黄曲霉素b1(afb1)、玉米赤霉烯酮(zen)、脱氧雪腐镰刀烯醇(don)、t-2毒素、赭曲霉素a(ota)、伏马毒素b1(fb1)、恩镰孢菌素a(enniatin a)等。一旦摄入，可能会导致急性或慢性疾病发作，如各种类型的癌症、消化道毒性白癜风、肝脏疾病、各种出血性综合征、人体免疫和神经紊乱等。由于气候、不恰当的生产方法和不良的作物储存条件，使得食品在生产链的各个阶段都容易受到真菌毒素污染，对人和动物健康造成极大威胁。

2、超高效液相色谱-高分辨率质谱联用(uhplc-hrms)技术因其灵敏度及分辨率高、动态线性范围宽、检测覆盖度广等优点，在食品基质的真菌毒素检测中得到广泛应用。然而目前研究多对某些特定的真菌毒素进行靶向分析，无法检测到通过反应、微生物或植物代谢形成的修饰型真菌毒素，如葡萄糖苷化、乙酰化、硫酸盐化产物等。研究表明修饰型真菌毒素可能具有与原型等同甚至更大的毒性。因此为了达到食品安全风险监测的目的，需要发展一种针对食品中真菌毒素的非靶向筛查技术。

3、本发明基于超高效液相色谱-高分辨质谱联用平台采集非靶向数据，对真菌毒素质谱特征进行提取，并利用该特征对食品样本中的真菌毒素进行非靶向筛查，结合保留时间、质谱碎裂规律及多源数据库进行结构识别。

技术实现思路

1、本发明为实现食品基质中真菌毒素的非靶向筛查，样本预处理后经超高效液相色谱-高分辨质谱联用平台同时采集一级、二级质谱数据，而后提取不同类别真菌毒素的质谱特征并实现样本数据的非靶向筛查，可疑物质结合保留时间、质谱碎裂规律及多源数据库进行结构识别。

2、本发明采用的具体技术方法如下：

3、(1)面粉样品经预处理后通过高效液相色谱-高分辨质谱采集非靶向数据信息。称取200mg小麦面粉于2ml离心管中，加入1ml乙腈-水-甲酸(79:20:1,v/v)提取剂，涡旋1min以混合均匀；采用恒温混匀仪(thermomixer c,thermo fisher scientific,rockford,il,u.s.a.)于室温下提取，恒温混匀仪的参数设置为速度800rpm震荡90分钟；随后将离心管置于离心机中在4℃，14000rpm的条件下离心10min，取600μl上清液至另一2ml离心管中，加入等量水-乙腈-甲酸(79:20:1,v/v)稀释剂，涡旋1min混匀，而后再次置于离心机中在4℃，14000rpm的条件下离心10min。取上清液转移至进样瓶，采用超高效液相色谱(uplc,waters,milford,ma,u.s.a.)-高分辨质谱(q exactive hf,thermo fisher scientific,rockford,il,u.s.a.)联用的一级、二级质谱同时采集方法进行分析，色谱分析流动相a、b分别为含有0.1％(v/v)甲酸的5mmol甲酸铵水和含有0.1％(v/v)甲酸的5mmol甲醇-水(95/5,v/v)溶液，流速为0.3ml/min，总的分析时间为12min，洗脱梯度为：0-1min为5％b，1-8min线性升至100％b，8-10min为100％b，10-10.1min降至5％b，10.1-12min为5％b平衡柱子。质谱碰撞能量为15、30、45ev混合能量。

4、(2)采集的原始数据通过仪器自带软件compound discoverer3.1进行峰匹配和峰提取，得到化合物峰表后进行背景干扰的扣除。具体为在每个溶剂空白(提取剂与稀释剂等体积混合)响应面积超过5×105的化合物被认为是实验过程的背景噪音干扰被删除。

5、(3)提取7类真菌毒素的质谱特征。将使用上述分析条件采集的45种真菌毒素标准样品溶液的二级质谱信息与开源质谱数据库massbank of north america(mona)收集的24个真菌毒素二级质谱信息经过一系列过滤及对比排序，分别给出每个类别真菌毒素出现频率大于50％的质谱特征，包括碎片离子和中性丢失。随后通过质谱结构解析软件massfrontier 8.0和每类真菌毒素的质谱分析相关文献进行结构确认，得到7类真菌毒素的质谱特征，认为出现频率大于等于0.87是必须满足的质谱特征，频率小于0.87认为是可能满足的质谱特征，以此设定筛查规则。

6、(4)对样本数据进行非靶向筛查。将采集到的样本原始数据经二级转换软件转换为含有二级碎片的mgf文件，并将每个mgf文件中的二级质谱信息与筛查规则进行比对，其中二级质谱碎片m/z的质量精度偏差小于10ppm，满足任意一类真菌毒素筛查规则的化合物再与峰表进行比对，与峰表化合物加合h+或nh4+的质量精度偏差小于5ppm，保留时间偏差小于0.2min的化合物被认为是可疑化合物。并结合保留时间、质谱碎裂规律，多源数据库(内部真菌毒素数据库、mona、metlin、drugbank等)对可疑化合物进行结构识别。该发明在复杂食品基质中真菌毒素的筛查方面具有明显优势，具有分析效率高，准确度高的优点。

技术特征：

1.一种针对食品中真菌毒素的非靶向筛查方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤(1)使用的预处理方法为：称取200mg食品样本于2ml离心管中，加入1ml乙腈-水-甲酸(79:20:1,v/v)提取剂，涡旋1min以混合均匀；采用恒温混匀仪于室温下提取，恒温混匀仪的参数设置为速度为800rpm的条件下震荡90分钟；随后将离心管置于离心机中在4℃，14000rpm的条件下离心10min，取600μl上清液至另一2ml离心管中，加入等体积量水-乙腈-甲酸(79:20:1,v/v)稀释剂，涡旋1min混匀，而后再次置于离心机中在4℃，14000rpm的条件下离心10min；取上清液转移至进样瓶进行下一步分析。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤(1)超高效液相色谱-高分辨质谱联用平台进行非靶向数据采集，具体参数为：采用超高效液相色谱-高分辨质谱联用的一级、二级质谱同时采集方法进行分析，二级采集模式为data dependent acquisition(dda)top 10，进样室温度为4℃，柱温为45℃，色谱柱为acquity beh c18 column，色谱流动相a、b分别为含有0.1％(v/v)甲酸的5mmol甲酸铵水和含有0.1％(v/v)甲酸的5mmol甲醇-水(95/5,v/v)溶液，流速为0.3ml/min，总分析时间为12min，洗脱梯度(v/v)为：0-1min保持5％b，1-8min线性升至100％b，8-10min为保持100％b，10-10.1min降至5％b，10.1-12min保持5％b平衡柱子；质谱碰撞能量为15、30、45ev混合能量。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤(2)的原始数据通过质谱仪器自带软件compound discoverer 3.1进行峰匹配和峰提取，得到化合物峰表，包括化合物质量、保留时间以及在每个样本中的响应面积信息；而后进行背景干扰的扣除，即在每个溶剂空白(提取剂与稀释剂等体积混合)中响应面积超过5×105的化合物被认为是实验过程中的背景噪音干扰被删除。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于：

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于：采用上述步骤(1)和步骤(2)分析方法对45种已有真菌毒素标准样品混合溶液采集二级质谱信息，和/或，于开源质谱数据库massbankof north america(mona)收集真菌毒素24个对应不同碰撞能量(质谱碰撞能量为小于等于45ev)的二级质谱，得到7类真菌毒素的质谱特征；

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤(3)利用质谱特征实现样品中真菌毒素的非靶向筛查，具体流程为：将采集到的样品原始数据经二级转换软件(osi-smms_export_ms2.7z)转换为含有保留时间、母离子质荷比、二级质谱碎片质荷比等信息的mgf文件，而后过滤掉相对强度小于1％的二级碎片，将样本的mgf文件中的二级质谱信息与上述确认的真菌毒素的筛查规则分别进行一一比对，其中二级质谱碎片m/z的质量精度偏差小于10ppm，满足任意一类真菌毒素筛查规则的化合物再与峰表进行比对，与峰表化合物加合h+或nh4+的质量精度偏差小于5ppm，保留时间偏差小于0.2min的化合物被认为是可疑化合物。

8.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤(3)并结合保留时间、质谱碎裂规律，包含有真菌毒素的信息数据库进行结构识别；数据库为自建真菌毒素数据库、mona、metlin、drugbank等中的一种或二种以上。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述食品样本为谷物样本，如：小麦，大米，玉米中的一种或二种以上。

技术总结
本发明公开了一种针对食品中真菌毒素的非靶向筛查方法。针对食品样本，使用超高效液相色谱‑高分辨质谱联用平台采集非靶向数据，构建真菌毒素质谱特征提取及非靶向筛查方法，结合保留时间、质谱碎裂规律及多源数据库进行结构识别。该发明在复杂食品基质中真菌毒素的筛查方面具有明显优势，具有分析效率高，准确度高的优点。

技术研发人员：许国旺,张宇杰,赵春霞,陈田田,梁雯莹,路鑫
受保护的技术使用者：中国科学院大连化学物理研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/2/19