一种涎液化糖链抗原检测试剂盒及制备方法与流程

1.本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种涎液化糖链抗原检测试剂盒及制备方法。


背景技术：

2.1985年，kohno等利用人肺腺癌细胞系(vmrc-lcr)免疫小鼠制备了多株单克隆抗体，将其中的第6号抗体识别的涎液化糖链抗原命名为krebs von den lungen-6，即kl-6。
3.kl-6是一种muc-1黏蛋白，通常表达在人体ⅱ型肺泡上皮细胞表面。当肺泡基底膜受损时，ⅱ型肺泡细胞为了进行修复损伤而增生，kl-6的生成也会随之增加。又由于病患的肺泡毛细血管被破坏后渗透性增强，因此kl-6会进入到血液中。
4.kl-6对判断ⅱ型肺泡上皮细胞的功能具有特异性。血清kl-6可反映肺泡损伤，ii型肺泡细胞再生和多种间质性肺疾病的活动度。kl-6水平能敏感地反映肺泡上皮和间质的损伤程度。近年来，多项研究报道了kl-6高水平表达可能与间质性肺疾病(ild)、急性肺损伤、放射性肺炎、病毒性肺炎、药物相关性间质性肺炎、肿瘤等疾病相关联。其作用可能是促进成纤维细胞增殖和迁徙，从而影响纤维化的发生和发展。
5.kl-6常用的检测方法有：酶联免疫法(elisa)、化学发光免疫分析法及胶乳凝集法等。采用elisa检测法，操作过程繁琐，复杂，无法开展高通量样本检测。使用化学发光免疫分析法必须在专用的化学发光仪上使用。胶乳凝集法，虽然克服了高通量样本检测的问题，但是目前现有的胶乳比浊检测试剂，对于低值范围区分度不高，临床样本的正常参考区间在低值范围，低值范围检测精准度不高往往影响结果判断。有些试剂为了达到较高灵敏度，刻意使用较大粒径的胶乳微球，则又存在试剂稳定性较差的问题。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种涎液化糖链抗原检测试剂盒及制备方法，以既保证低高值检测区均有较高的灵敏度和精准度，又保证试剂长期存储有足够的稳定性。
7.一种涎液化糖链抗原检测试剂盒，包括r1试剂、r2试剂：
8.所述的r1试剂包括：
9.50～120mmol/l磷酸盐缓冲液、50～80mmol/l氯化钠、2～5mmol/l edta-2na、2～5％bsa、0.5～2％胆酸钠、0.1～1％tergitol(tm)np-40、1～5％聚乙二醇20000、0.05～0.10％proclin 300，r1试剂的ph值为6.8～7.3；
10.所述的r2试剂包括：
11.20～50mmol/l的hepes缓冲液、5～10％海藻糖、3～7％甘露醇、0.1％的包被人涎液化糖链抗原抗体的胶乳微球、0.1％的吐温-20、0.04～0.10％的pc-300，r2试剂的ph值为6.8～7.3。
12.上述涎液化糖链抗原检测试剂盒，其中，包被人涎液化糖链抗原抗体的胶乳微球为80～120nm及200～300nm两种规格的胶乳微球按一定比例混合而成。
13.上述涎液化糖链抗原检测试剂盒，其中，包被人涎液化糖链抗原抗体的胶乳微球为80～120nm及200～300nm两种规格的胶乳微球按照1：3～3：1的比例混合而成。
14.上述涎液化糖链抗原检测试剂盒，其中，包被人涎液化糖链抗原抗体的胶乳微球为100nm及240nm两种规格的胶乳微球的按照按1：3～3：1比例混合而成。
15.上述涎液化糖链抗原检测试剂盒，其中，包被人涎液化糖链抗原抗体的胶乳微球80～120nm及200～300nm两种规格的胶乳微球按照1：1的比例混合而成。
16.一种涎液化糖链抗原检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
17.步骤1，将磷酸盐、氯化钠、edta-2na、bsa、胆酸钠、tergitol(tm)np-40、聚乙二醇20000、proclin 300溶于蒸馏水中，超声均匀，调节试剂ph值为6.8～7.3，即得r1试剂；
18.步骤2，将hepes、海藻糖、甘露醇、吐温-20、pc-300，溶于蒸馏水中，超声均匀，调节试剂ph值为6.8～7.3，得r2试剂缓冲保存液，将r2试剂缓冲保存液置于低速磁力搅拌器上，慢慢加入包被人涎液化糖链抗原抗体的胶乳微球至0.1％浓度，混合均匀，即得r2试剂。
19.上述制备方法，其中，步骤2中，制备包被人涎液化糖链抗原抗体的胶乳微球步骤包括：
20.步骤2.1，准备粒径为80～120nm的羧基胶乳微球，加入2-吗啉乙磺酸溶液，混合均匀，离心除去上清液，重复多次得清洗胶乳微球；准备粒径为200～300nm的羧基胶乳微球，加入2-吗啉乙磺酸溶液，离心除去上清液，重复多次得清洗胶乳微球；
21.步骤2.2，向清洗过的80～120nm的羧基胶乳微球中加入2-吗啉乙磺酸溶液，执行水浴超声使微球呈单分散状态，再加入活性剂活化胶乳，震荡反应10～20min，得80～120nm的活化胶乳；向上述清洗的200～300nm的羧基胶乳微球中加入2-吗啉乙磺酸溶液，执行水浴超声使微球呈单分散状态，再加入活性剂活化胶乳，震荡反应10～20min，得200～300nm的活化胶乳；
22.步骤2.3，将上述80～120nm活化胶乳离心，去除上清液，加入磷酸盐缓冲液重悬微球，离心，去除上清液，再加入磷酸盐缓冲液重悬微球，水浴超声使微球呈单分散状态，将人涎液化糖链抗原抗体溶液逐滴加入，37℃下震荡反应2.5h，加入终止液继续震荡反应20min，离心去除上清液后再加入封闭液继续震荡反应20min，得第一份偶联抗体胶乳；将上述200～300nm活化胶乳离心，去除上清液，加入磷酸盐缓冲液重悬微球，离心，去除上清液，再加入磷酸盐缓冲液重悬微球，水浴超声使微球呈单分散状态，将人涎液化糖链抗原抗体溶液逐滴加入，37℃下震荡反应2.5h，加入终止液继续震荡反应20min，离心去除上清液后再加入封闭液继续震荡反应20min，得第二份偶联抗体胶乳；
23.步骤2.4，将第一份偶联抗体胶乳和第二份偶联抗体胶乳在低速磁力搅拌器上按照1：3～3：1混合均匀，离心去除上清液，用r2试剂缓冲保存液重悬，超声分散为均匀溶液即得包被人涎液化糖链抗原抗体的胶乳微球。
24.上述制备方法，其中，2-吗啉乙磺酸溶液的浓度为20～50mmol/l，ph为6.0～6.5。
25.上述制备方法，其中，所述活性剂的用量为10～20mg/l，所述活性剂为碳化亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺，二者的质量比为1:1。
26.上述制备方法，其中，所述终止液为50-100mg/ml的乙醇胺、赖氨酸或甘氨酸溶液，所述封闭液为10-30mg/ml的牛血清蛋白。
27.上述制备方法，其中，磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾和磷酸氢二钠，浓度为20～
60mmol/l，ph为6.5～7.2。
28.上述制备方法，其中，水浴超声均为循环执行超声2s和停止4s，水浴超声的持续时间为2～5min，超声采用40～50hz进行。
29.本发明的有益效果：
30.本发明提供一种涎液化糖链抗原检测试剂盒及制备方法，既能保证低高值检测区均有较高的灵敏度和精准度，又能保证试剂长期存储有足够的稳定性，可于全自动生化仪上高通量检测临床样本。
附图说明
31.图1是本发明实施例1制备的试剂盒和对比例1制备的试剂盒的校准曲线；
32.图2是本发明实施例2制备的试剂盒和对比例2制备的试剂盒的校准曲线；
33.图3是本发明实施例3制备的试剂盒和对比例4制备的试剂盒的校准曲线；
34.图4是本发明实施例4制备的试剂盒和对比例4制备的试剂盒的校准曲线；
35.图5是本发明实施例1制备的试剂盒37℃热破稳定性试验结果图；
36.图6是对比例1制备的试剂盒37℃热破稳定性试验结果图；
37.图7是本发明实施例1制备的检测试剂盒与市售试剂结果的相关性结果。
具体实施方式
38.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
39.实施例1
40.一种涎液化糖链抗原检测试剂盒，包括r1试剂、r2试剂。
41.其中r1试剂包括：50mmol/l磷酸盐缓冲液、50mmol/l氯化钠、2mmol/l edta-2na、2％bsa、0.5％胆酸钠、0.1％tergitol(tm)np-40、1％聚乙二醇20000、0.05％proclin 300，r1试剂的ph值为6.8；
42.其中r2试剂包括：20mmol/l的hepes缓冲液、5％海藻糖、3％甘露醇、0.1％的包被人涎液化糖链抗原抗体的胶乳微球、0.1％的吐温-20、0.04％的pc-300，r2试剂的ph值为6.8；
43.所述的检测试剂盒，包被人涎液化糖链抗原抗体的胶乳微球为80nm及200nm大小两种规格的胶乳微球按1：1比例混合而成。
44.上述试剂盒的制备方法包括以下步骤：
45.步骤1，将磷酸盐、氯化钠、edta-2na、bsa、胆酸钠、tergitol(tm)np-40、聚乙二醇20000、proclin 300溶于蒸馏水中，超声均匀，调节试剂ph值为6.8，即得r1试剂；
46.步骤2，将hepes、海藻糖、甘露醇、吐温-20、pc-300，溶于蒸馏水中，超声均匀，调节试剂ph值为6.8，得r2试剂缓冲保存液，将r2试剂缓冲保存液置于低速磁力搅拌器上，慢慢加入包被人涎液化糖链抗原抗体的胶乳微球至0.1％浓度，混合均匀，即得r2试剂。
47.步骤2中，包被人涎液化糖链抗原抗体的胶乳微球制备步骤包括：
48.步骤2.1，准备10ml粒径为80nm的羧基胶乳微球，加入2-吗啉乙磺酸溶液30ml，混合均匀，离心除去上清液，重复多次得清洗胶乳微球；准备10ml粒径为200nm的羧基胶乳微球，加入2-吗啉乙磺酸溶液30ml，离心除去上清液，重复多次得清洗胶乳微球；
49.步骤2.2，向上述清洗过的80nm的羧基胶乳微球中加入2-吗啉乙磺酸溶液50ml，执行水浴超声使微球呈单分散状态，加入碳化亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺活性剂活化胶乳，震荡反应15min，得80nm的活化胶乳；向上述清洗过的200nm的羧基胶乳微球中加入2-吗啉乙磺酸溶液50ml，执行水浴超声使微球呈单分散状态，加入碳化亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺活性剂活化胶乳，震荡反应15min，得200nm的活化胶乳；
50.步骤2.3，将上述80nm活化胶乳离心，去除上清液，加入磷酸盐缓冲液重悬微球，离心，去除上清液，再加入磷酸盐缓冲液50ml重悬微球，水浴超声使微球呈单分散状态，将6mg/ml人涎液化糖链抗原抗体4ml溶液逐滴加入，37℃下震荡反应2.5h，加入乙醇胺终止液1ml继续震荡反应20min，离心去除上清液后再加入牛血清蛋白封闭液1ml继续震荡反应20min，得第一份偶联抗体胶乳；将上述200nm活化胶乳离心，去除上清液，加入磷酸盐缓冲液重悬微球，离心，去除上清液，再加入磷酸盐缓冲液50ml重悬微球，水浴超声使微球呈单分散状态，将6mg/ml人涎液化糖链抗原抗体4ml溶液逐滴加入，37℃下震荡反应2.5h，加入乙醇胺终止液1ml继续震荡反应20min，离心去除上清液后再加入牛血清蛋白封闭液1ml继续震荡反应20min，得第二份偶联抗体胶乳；
51.步骤2.4，将所述第一份偶联抗体胶乳和第二份偶联抗体胶乳在低速磁力搅拌器上按照1：1混合均匀，离心去除上清液，用r2试剂缓冲保存液重悬至0.1％浓度，超声分散为均匀溶液即得包被人涎液化糖链抗原抗体的胶乳微球。
52.其中，所述2-吗啉乙磺酸的溶液浓度均为50mmol/l，ph为6.0。
53.其中，所述活性剂用量为10mg/l，所述活性剂为碳化亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺，二者的质量比为1:1。
54.其中，所述磷酸盐为磷酸二氢钾和磷酸氢二钠，浓度为60mmol/l，ph为7.0。
55.其中，所述终止液为50mg/ml的乙醇胺溶液，所述封闭液为30mg/ml的牛血清蛋白。
56.其中，所述水浴超声为循环超声2s和停止4s，持续时间为2min，超声采用50hz进行。
57.实施例2
58.一种涎液化糖链抗原检测试剂盒，它包括r1试剂、r2试剂。
59.其中r1试剂：120mmol/l磷酸盐缓冲液、80mmol/l氯化钠、5mmol/l edta-2na、5％bsa、2％胆酸钠、1％tergitol(tm)np-40、5％聚乙二醇20000、0.10％proclin 300，r1试剂的ph值为7.3；
60.其中r2试剂：50mmol/l的hepes缓冲液、10％海藻糖、7％甘露醇、0.1％的包被人涎液化糖链抗原抗体的胶乳微球、0.5％的吐温-20、0.10％的pc-300，r2试剂的ph值为7.3。
61.所述的检测试剂盒，包被人涎液化糖链抗原抗体的胶乳微球为120nm及300nm大小两种规格的胶乳微球按1：1比例混合而成。
62.上述试剂盒的制备方法包括以下步骤：
63.步骤1，将磷酸盐、氯化钠、edta-2na、bsa、胆酸钠、tergitol(tm)np-40、聚乙二醇20000、proclin 300溶于蒸馏水中，超声均匀，调节试剂ph值为7.3，即得r1试剂；
64.步骤2，将hepes、海藻糖、甘露醇、吐温-20、pc-300，溶于蒸馏水中，超声均匀，调节试剂ph值为7.3，得r2试剂缓冲保存液，将r2试剂缓冲保存液置于低速磁力搅拌器上，慢慢加入包被人涎液化糖链抗原抗体的胶乳微球至0.1％浓度，混合均匀，即得r2试剂。
65.所述r2试剂中包被人涎液化糖链抗原抗体的胶乳微球制备如下：
66.步骤2.1，准备10ml粒径为120nm的羧基胶乳微球，加入2-吗啉乙磺酸溶液30ml，混合均匀，离心除去上清液，重复多次得清洗胶乳微球；准备10ml粒径为300nm的羧基胶乳微球，加入2-吗啉乙磺酸溶液30ml，离心除去上清液，重复多次得清洗胶乳微球；
67.步骤2.2，向上述清洗过的120nm的羧基胶乳微球中加入2-吗啉乙磺酸溶液50ml，执行水浴超声使微球呈单分散状态，加入碳化亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺活性剂活化胶乳，震荡反应15min，得120nm的活化胶乳；向上述清洗过的300nm的羧基胶乳微球中加入2-吗啉乙磺酸溶液50ml，执行水浴超声使微球呈单分散状态，加入碳化亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺活性剂活化胶乳，震荡反应15min，得300nm的活化胶乳；
68.步骤2.3，将上述120nm活化胶乳离心，去除上清液，加入磷酸盐缓冲液重悬微球，离心，去除上清液，再加入磷酸盐缓冲液50ml重悬微球，水浴超声使微球呈单分散状态，将6mg/ml人涎液化糖链抗原抗体4ml溶液逐滴加入，37℃下震荡反应2.5h，加入乙醇胺终止液1ml继续震荡反应20min，离心去除上清液后再加入牛血清蛋白封闭液1ml继续震荡反应20min，得第一份偶联抗体胶乳；将上述300nm活化胶乳离心，去除上清液，加入磷酸盐缓冲液重悬微球，离心，去除上清液，再加入磷酸盐缓冲液50ml重悬微球，水浴超声使微球呈单分散状态，将6mg/ml人涎液化糖链抗原抗体4ml溶液逐滴加入，37℃下震荡反应2.5h，加入乙醇胺终止液1ml继续震荡反应20min，离心去除上清液后再加入牛血清蛋白封闭液1ml继续震荡反应20min，得第二份偶联抗体胶乳；
69.步骤2.4，将所述第一份偶联抗体胶乳和第二份偶联抗体胶乳在低速磁力搅拌器上按照1：1混合均匀，离心去除上清液，用r2试剂缓冲保存液重悬至0.1％浓度，超声分散为均匀溶液即得包被人涎液化糖链抗原抗体的胶乳微球。
70.其中，所述2-吗啉乙磺酸的溶液浓度均为20mmol/l，ph为6.0。
71.其中，所述活性剂用量为20mg/l，上述活性剂为碳化亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺，二者的质量比为1:1。
72.其中，所述磷酸盐为磷酸二氢钾和磷酸氢二钠，浓度为20mmol/l，ph为7.0。
73.其中，所述终止液为100mg/ml的甘氨酸溶液，所述封闭液为10mg/ml的牛血清蛋白。
74.其中，所述水浴超声为循环超声2s和停止4s，持续时间为5min，超声采用40hz进行。
75.实施例3
76.一种涎液化糖链抗原检测试剂盒，它包括r1试剂、r2试剂。
77.其中r1试剂包括：80mmol/l磷酸盐缓冲液、60mmol/l氯化钠、3mmol/l edta-2na、3％bsa、1％胆酸钠、0.4％tergitol(tm)np-40、2％聚乙二醇20000、0.07％proclin 300，r1试剂的ph值为7.0；
78.其中r2试剂包括：30mmol/l的hepes缓冲液、6％海藻糖、4％甘露醇、0.1％的包被人涎液化糖链抗原抗体的胶乳微球、0.2％的吐温-20、0.06％的pc-300，r2试剂的ph值为
7.0。
79.所述的检测试剂盒，包被人涎液化糖链抗原抗体的胶乳微球为100nm及240nm大小两种规格的胶乳微球按1：3比例混合而成。
80.上述试剂盒的制备方法包括以下步骤：
81.步骤1，将磷酸盐、氯化钠、edta-2na、bsa、胆酸钠、tergitol(tm)np-40、聚乙二醇20000、proclin 300溶于蒸馏水中，超声均匀，调节试剂ph值为7.0，即得r1试剂；
82.步骤2，将hepes、海藻糖、甘露醇、吐温-20、pc-300，溶于蒸馏水中，超声均匀，调节试剂ph值为7.0，得r2试剂缓冲保存液，将r2试剂缓冲保存液置于低速磁力搅拌器上，慢慢加入包被人涎液化糖链抗原抗体的胶乳微球至0.1％浓度，混合均匀，即得r2试剂。
83.步骤2中，包被人涎液化糖链抗原抗体的胶乳微球制备步骤包括：
84.步骤2.1，准备10ml粒径为100nm的羧基胶乳微球，加入2-吗啉乙磺酸溶液30ml，混合均匀，离心除去上清液，重复多次得清洗胶乳微球；准备10ml粒径为240nm的羧基胶乳微球，加入2-吗啉乙磺酸溶液30ml，离心除去上清液，重复多次得清洗胶乳微球；
85.步骤2.2，向上述清洗过的100nm的羧基胶乳微球中加入2-吗啉乙磺酸溶液50ml，执行水浴超声使微球呈单分散状态，加入碳化亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺活性剂活化胶乳，震荡反应20min，得100nm的活化胶乳；向上述清洗过的240nm的羧基胶乳微球中加入2-吗啉乙磺酸溶液50ml，执行水浴超声使微球呈单分散状态，加入碳化亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺活性剂活化胶乳，震荡反应20min，得240nm的活化胶乳；
86.步骤2.3，将上述100nm活化胶乳离心，去除上清液，加入磷酸盐缓冲液重悬微球，离心，去除上清液，再加入磷酸盐缓冲液50ml重悬微球，水浴超声使微球呈单分散状态，将6mg/ml人涎液化糖链抗原抗体4ml溶液逐滴加入，37℃下震荡反应2.5h，加入乙醇胺终止液1ml继续震荡反应20min，离心去除上清液后再加入牛血清蛋白封闭液1ml继续震荡反应20min，得第一份偶联抗体胶乳；将上述240nm活化胶乳离心，去除上清液，加入磷酸盐缓冲液重悬微球，离心，去除上清液，再加入磷酸盐缓冲液50ml重悬微球，水浴超声使微球呈单分散状态，将6mg/ml人涎液化糖链抗原抗体4ml溶液逐滴加入，37℃下震荡反应2.5h，加入乙醇胺终止液1ml继续震荡反应20min，离心去除上清液后再加入牛血清蛋白封闭液1ml继续震荡反应20min，得第二份偶联抗体胶乳；
87.步骤2.4，将所述第一份偶联抗体胶乳和第二份偶联抗体胶乳在低速磁力搅拌器上按照1：3混合均匀，离心去除上清液，用r2试剂缓冲保存液重悬至0.1％浓度，超声分散为均匀溶液即得。
88.其中，所述2-吗啉乙磺酸的溶液浓度均为25mmol/l，ph为6.5。
89.其中，所述活性剂用量为15mg/l，上述活性剂为碳化亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺，二者的质量比为1:1。
90.其中，所述磷酸盐为磷酸二氢钾和磷酸氢二钠，浓度为50mmol/l，ph为6.8。
91.其中，所述终止液为70mg/ml的乙醇胺溶液，所述封闭液为20mg/ml的牛血清蛋白。
92.其中，所述水浴超声为循环超声2s和停止4s，持续时间为4min，超声采用40hz进行。
93.实施例4
94.一种涎液化糖链抗原检测试剂盒，包括r1试剂、r2试剂。
95.其中r1试剂包括：100mmol/l磷酸盐缓冲液、70mmol/l氯化钠、4mmol/l edta-2na、4％bsa、1.5％胆酸钠、0.8％tergitol(tm)np-40、4％聚乙二醇20000、0.08％proclin 300，r1试剂的ph值为7.0；
96.其中r2试剂包括：40mmol/l的hepes缓冲液、8％海藻糖、5％甘露醇、0.1％的包被人涎液化糖链抗原抗体的胶乳微球、0.4％的吐温-20、0.08％的pc-300，r2试剂的ph值为7.0。
97.所述的检测试剂盒，包被人涎液化糖链抗原抗体的胶乳微球为100nm及240nm大小两种规格的胶乳微球按3：1比例混合而成。
98.上述试剂盒的制备方法包括以下步骤：
99.步骤1，将磷酸盐、氯化钠、edta-2na、bsa、胆酸钠、tergitol(tm)np-40、聚乙二醇20000、proclin 300溶于蒸馏水中，超声均匀，调节试剂ph值为7.0，即得r1试剂；
100.步骤2，将hepes、海藻糖、甘露醇、吐温-20、pc-300，溶于蒸馏水中，超声均匀，调节试剂ph值为7.0，得r2试剂缓冲保存液，将r2试剂缓冲保存液置于低速磁力搅拌器上，慢慢加入包被人涎液化糖链抗原抗体的胶乳微球至0.1％浓度，混合均匀，即得r2试剂。
101.所述r2试剂中包被人涎液化糖链抗原抗体的胶乳微球制备如下：
102.步骤2.1，准备10ml粒径为100nm的羧基胶乳微球，加入2-吗啉乙磺酸溶液30ml，混合均匀，离心除去上清液，重复多次得清洗胶乳微球；准备10ml粒径为240nm的羧基胶乳微球，加入2-吗啉乙磺酸溶液30ml，离心除去上清液，重复多次得清洗胶乳微球；
103.步骤2.2，向上述清洗过的100nm的羧基胶乳微球中加入2-吗啉乙磺酸溶液50ml，执行水浴超声使微球呈单分散状态，加入碳化亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺活性剂活化胶乳，震荡反应20min，得100nm的活化胶乳；向上述清洗过的240nm的羧基胶乳微球中加入2-吗啉乙磺酸溶液50ml，执行水浴超声使微球呈单分散状态，加入碳化亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺活性剂活化胶乳，震荡反应20min，得240nm的活化胶乳；
104.步骤2.3，将上述100nm活化胶乳离心，去除上清液，加入磷酸盐缓冲液重悬微球，离心，去除上清液，再加入磷酸盐缓冲液50ml重悬微球，水浴超声使微球呈单分散状态，将6mg/ml人涎液化糖链抗原抗体4ml溶液逐滴加入，37℃下震荡反应2.5h，加入乙醇胺终止液1ml继续震荡反应20min，离心去除上清液后再加入牛血清蛋白封闭液1ml继续震荡反应20min，得第一份偶联抗体胶乳；将上述240nm活化胶乳离心，去除上清液，加入磷酸盐缓冲液重悬微球，离心，去除上清液，再加入磷酸盐缓冲液50ml重悬微球，水浴超声使微球呈单分散状态，将6mg/ml人涎液化糖链抗原抗体4ml溶液逐滴加入，37℃下震荡反应2.5h，加入乙醇胺终止液1ml继续震荡反应20min，离心去除上清液后再加入牛血清蛋白封闭液1ml继续震荡反应20min，得第二份偶联抗体胶乳；
105.步骤2.4，将所述第一份偶联抗体胶乳和第二份偶联抗体胶乳在低速磁力搅拌器上按照3：1混合均匀，离心去除上清液，用r2试剂缓冲保存液重悬至0.1％浓度，超声分散为均匀溶液即得包被人涎液化糖链抗原抗体的胶乳微球。
106.其中，所述2-吗啉乙磺酸的溶液浓度均为40mmol/l，ph为6.2。
107.其中，所述活性剂用量为15mg/l，所述活性剂为碳化亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺，二者的质量比为1:1。
108.其中，所述磷酸盐为磷酸二氢钾和磷酸氢二钠，浓度为40mmol/l，ph为7.0。
109.其中，所述终止液为70mg/ml的赖氨酸溶液，所述封闭液为18mg/ml的牛血清蛋白。
110.其中，所述水浴超声为循环超声2s和停止4s，持续时间为3min，超声采用50hz进行。
111.对比例1
112.只使用80nm胶乳微球制备偶联抗体胶乳，其余与实施例1相同。
113.对比例2
114.只使用120nm胶乳微球制备偶联抗体胶乳，其余与实施例2相同。
115.对比例3
116.只使用200nm胶乳微球制备偶联抗体胶乳，其余与实施例3相同。
117.对比例4
118.只使用300nm胶乳微球制备偶联抗体胶乳，其余与实施例4相同。
119.各实施例及对比例均在全自动生化分析仪进行分析检测。
120.测试条件与方法
121.仪器：日立7180全自动生化分析仪
122.参数：
123.主波长570℃样品3μl次波长800℃试剂1180μl反应温度37℃试剂260μl反应方向升反应反应类型终点法
124.反应步骤
[0125][0126]
计算δa＝a2-a1。根据多点校准品浓度和对应吸光度变化值δa，采用多点非线性校准模式确定工作曲线，样本吸光度变化在工作曲线上相对应的浓度值即为测定浓度。
[0127]
试验1：本发明各实施例检测试剂盒与对比例检测试剂盒线性范围
[0128]
试验方法：取浓度梯度为0iu/ml，500iu/ml，1000iu/ml，2000iu/ml，4000iu/ml和6000iu/ml的校准品溶液，用本发明实施例1-4所制备的检测试剂盒、对比例1-4所制备的检测试剂盒对其进行检测，绘制各检测试剂盒校准工作曲线。
[0129]
试验结果：请参阅图1至图4，根据各试剂盒检测结果所绘制的校准工作曲线可见，
实施例1-4所制备的检测试剂盒检测体系全浓度范围内均表现良好的灵敏度和线性范围，显著优于对比例1-4。
[0130]
试验2：本发明各实施例检测试剂盒与对比例检测试剂盒样本检测的准确度
[0131]
试验方法：制备浓度不同的20个样本，经标准试剂准确定值后，用本发明实施例1-4所制备的检测试剂盒、对比例1-4所制备的检测试剂盒对其进行检测，计算检测结果的偏差。
[0132]
表1本发明实施例1-4检测试剂盒检测样本的准确度
[0133][0134]
表2对比例1-4检测试剂盒检测样本的准确度
[0135]
[0136][0137]
试验结果：从上述表1和表2结果可知，本发明实施例1-4所制备的检测试剂盒检测样本的结果与定值偏差较小，均小于7％。而对比例1-4检测试剂盒检测样本的结果与定值偏差则较大，基本都大于10％以上，且在低值和高值区偏大更大，说明对比例检测试剂盒在低值范围内灵敏度较低，而在高值区则线性较差，导致检测结果偏差明显。本发明检测试剂盒的准确性要明显优于对比例检测试剂盒。
[0138]
试验3本发明实施例1试剂盒与对比例1试剂盒热破稳定性试验
[0139]
试验方法：将本发明实施例1所制备的检测试剂盒与对比例1制备的检测试剂盒，于37℃分别热处理0天、3天、5天和7天，并于不同的处理时间之后分别测定校准品，记录其δa值，绘制其变化曲线。
[0140]
试验结果：本发明实施例1检测试剂盒的37℃热稳定性试验结果见图5，对比例1检测试剂盒37℃热稳定性试验结果见图6。从图5及图6的结果可知，本发明实施例1所制备的检测试剂盒37℃热处理稳定性好，可靠的稳定性保证了其测值的准确性，更适合于临床诊断。
[0141]
试验4本发明实施例1的检测试剂盒与市售试剂测试结果的相关性
[0142]
试验方法：用本发明实施例1制备的检测试剂盒与市售涎液化糖链抗原检测试剂(胶乳凝集比浊法，积水医疗株式会社sekisui medical co.,ltd.)测定血清样本中的涎液化糖链抗原含量，对两个试剂盒测定的结果进行回归分析，考察两种试剂盒检测结果的相关性。
[0143]
试验结果：试验结果见图7，从试验结果可发现，本发明实施例1制备的检测试剂盒与市售涎液化糖链抗原胶乳凝集比浊法测值相关性良好。
[0144]
综上，本发明提供的涎液化糖链抗原检测试剂盒及制备方法，既能保证低高值检测区均有较高的灵敏度和精准度，又能保证试剂长期存储有足够的稳定性，可于全自动生化仪上高通量检测临床样本。
[0145]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0146]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。