一种基于超高效液相色谱串联质谱法测定茶叶和茶汤中唑虫酰胺4种代谢产物的方法

本发明属于茶叶农药残留检测，具体涉及一种基于超高效液相色谱串联质谱法测定茶叶和茶汤中唑虫酰胺4种代谢产物的方法。

背景技术：

1、茶叶是我国重要经济作物。据统计，2020年我国茶园面积达326.1万公顷，茶叶产量318万吨，同比2019年增产7.1％。茶树多生长于温暖湿润的环境，易遭受病虫害侵袭，目前，化学防治仍是茶树病虫害防治的主要手段。作为一种广受欢迎的饮品，人们习惯饮用茶汤，弃去茶叶残渣，因此茶汤是评价安全性的重要载体，选用高效低水溶解度的农药对于保障茶叶质量安全和消费者饮茶安全具有重要意义。唑虫酰胺是原日本三菱化学公司开发的新型吡唑杂环类杀虫杀螨剂，主要作用于昆虫呼吸系统的能量代谢过程，抑制线粒体复合体i的电子传递，从而阻止能量代谢中的氧化磷酸化过程。该药以触杀为主，杀虫谱广，杀虫迅速，不具备內吸传导性。此外，唑虫酰胺还具备水溶解度低(0.087mg/l)，防治效果好等优点，被作为防治茶小绿叶蝉的优良药剂在我国登记并推广使用，仅2011-2013年，已在我国4大茶区15个省示范推广，施用面积约达35万亩，目前唑虫酰胺已在我国茶园广泛应用，前景广阔。我国食品安全国家标准gb2763-2021制定茶叶中唑虫酰胺的最大残留限量为50mg/kg；美国、加拿大为30mg/kg，日本为20mg/kg，欧盟为一律标准0.01mg/kg。

2、近年来，除农药母体外，农产品和食品中的农药代谢降解产物亦受到广泛关注。国际农药残留联席会议jmpr报告报道了唑虫酰胺在一些作物如茄子，卷心菜，桃子中的代谢产物，例如pt-oh，pt-ca，oh-pt，oh-t-ca，ca-t-ca，oh-t-oh，ca-t-am等。其中pt-ca及oh-pt对大鼠的急性经口毒性均大于母体，可能带来更大的安全风险。而目前关于唑虫酰胺的研究主要集中于母体，包括防效、检测方法及在不同作物中的消解残留规律，关于代谢产物的研究仍然匮乏，尚无农产品中唑虫酰胺代谢产物的检测方法。

3、本申请人前期利用飞行时间质谱，分析鉴定出唑虫酰胺在茶树中的四种代谢产物：pt-oh，pt-ca，oh-t-ca和ca-t-ca，并获得标准品。本发明针对唑虫酰胺4种代谢产物，建立了其在茶鲜叶、绿茶、红茶、绿茶茶汤和红茶茶汤基质中的残留分析方法。为了解唑虫酰胺在茶树施用后及后续加工、冲泡过程中代谢产物的生成转移和安全性评估提供方法基础，对于保障茶叶质量安全具有重要意义。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种基于超高效液相色谱串联质谱法测定茶叶和茶汤中唑虫酰胺4种代谢产物的方法的技术方案，该方法解决现有技术中无法对茶叶中唑虫酰胺代谢产物的残留量进行检测、及无法监测唑虫酰胺在茶树施用后及后续茶叶加工、冲泡过程中代谢产物残留行为的技术问题。

2、本发明具体通过以下技术方案实现：

3、所述的一种基于超高效液相色谱串联质谱法测定茶叶和茶汤中唑虫酰胺4种代谢产物的方法，其包括以下步骤：

4、1)样品提取净化：取粉碎后的茶鲜叶或茶叶样品，1％甲酸乙腈提取，c18、mgso4、gcb和cnt-oh分散固相萃取净化，浓缩后乙腈定容，过0.22μm有机膜，待测；

5、或1)样品提取：对茶汤样品1％甲酸乙腈提取，浓缩后乙腈定容，过0.22μm有机膜，待测；

6、2)采用acquity uplc hss t3色谱柱分离，超高相液相色谱-串联质谱uplc-ms/ms检测唑虫酰胺4种代谢产物；

7、3)配制唑虫酰胺4种代谢产物标准储备液，并用乙腈稀释成混合标准溶液100mg/l，然后分别用步骤1)处理后的茶鲜叶、茶叶和茶汤基质及乙腈逐级稀释成5.0、1.0、0.50、0.10、0.050、0.010mg/l的标准溶液；每个浓度用uplc-ms/ms进样测定3次，以浓度为横坐标x，峰面积平均值为纵坐标y，得到唑虫酰胺代谢产物在一定浓度范围内的标准曲线，计算得出线性相关系数、基质效应及方法检出限lod；

8、4)通过添加回收试验计算验证方法的回收率、相对标准偏差及定量限loq，满足残留分析要求；

9、上述唑虫酰胺4种代谢产物的名称、化学结构式、分子式和相对分子质量为：

10、

11、进一步，所述步骤1)中茶鲜叶或茶叶样品提取净化具体包括：称取磨碎后的茶鲜叶样品2.0g或干茶样品1.0g于50ml聚四氟乙烯离心管，加入5ml纯净水涡旋混匀，静置30min，加入10ml1％甲酸乙腈溶液，涡旋混匀；静置2h后，加入5.0gnacl，振荡5min，涡旋混匀，超声30min，10000r/min转速下离心5min；转移全部上清液，重复提取1次，合并上清液并涡旋混匀；取7.5ml上清于鸡心瓶中，于40℃下水浴旋转蒸发浓缩至干，乙腈定容至1.5ml；转移至装有50mgc18、50mgmgso4、20mggcb和20mgcnt-oh的2ml离心管中，涡旋，于12000r/min转速下离心5min，上清过0.22μm有机滤膜，uplc-ms/ms待测。

12、进一步，所述步骤1)中茶汤样品提取净化具体包括：干茶按照茶/水比例1/50v/v，水温100℃，冲泡5min后，双层滤纸过滤，得到茶汤样品；取20ml茶汤置于50ml聚四氟乙烯离心管，加入20ml1％甲酸乙腈溶液，涡旋，加入8.0gnacl，涡旋，振荡5min，以10000r/min转速离心5min；分层后，转移全部上清，重复提取1次，合并上清液并涡旋混匀，取20ml上清于40℃下水浴旋转蒸发浓缩至干，乙腈定容至1.5ml，过0.22μm有机滤膜，uplc-ms/ms测定。

13、进一步，所述步骤2)中色谱条件为：acquity uplc hss t3色谱柱规格100mm×2.1mm，1.8μm，柱温40℃，流速0.2ml/min，进样量5μl；流动相a为0.1％甲酸甲醇，b为0.1％甲酸水溶液；梯度洗脱程序为：10％-65％a，0-1.5min；65％-85％a，1.5-5.0min；85％-99％a，5.0-7.5min；99％-100％a，7.5-9min；100％a，9-9.8min，100％-90％a，9.8-10.3min。

14、进一步，所述步骤2)中质谱条件为：电喷雾正电离/负电离多反应监测模式；电喷雾毛细管电压3.5kv；离子源温度150℃；脱溶剂气n2温度350℃，流速为650l/hr；锥孔反吹气n2流速为50l/hr；碰撞气ar流速0.25ml/min。

15、本发明方法4种代谢产物在不同基质中的标准曲线线性相关系数均在0.99以上，平均添加回收率在75.85％-114.97％，相对标准偏差小于18.5％，方法定量限小于等于0.05mg/kg。该发明方法满足残留分析要求，能够为茶鲜叶、茶叶和茶汤中唑虫酰胺4种代谢产物的研究检测提供分析方法。

技术特征：

1.一种基于超高效液相色谱串联质谱法测定茶叶和茶汤中唑虫酰胺4种代谢产物的方法，其特征在于包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的一种基于超高效液相色谱串联质谱法测定茶叶和茶汤中唑虫酰胺4种代谢产物的方法，其特征在于所述步骤1)中茶鲜叶或茶叶样品提取净化具体包括：称取磨碎后的茶鲜叶样品2.0g或干茶样品1.0g于50ml聚四氟乙烯离心管，加入5ml纯净水涡旋混匀，静置30min，加入10ml 1％甲酸乙腈溶液，涡旋混匀；静置2h后，加入5.0gnacl，振荡5min，涡旋混匀，超声30min，10000r/min转速下离心5min；转移全部上清液，重复提取1次，合并上清液并涡旋混匀；取7.5ml上清于鸡心瓶中，于40℃下水浴旋转蒸发浓缩至干，乙腈定容至1.5ml；转移至装有50mgc18、50mgmgso4、20mggcb和20mgcnt-oh的2ml离心管中，涡旋，于12000r/min转速下离心5min，上清过0.22μm有机滤膜，uplc-ms/ms待测。

3.如权利要求1所述的一种基于超高效液相色谱串联质谱法测定茶叶和茶汤中唑虫酰胺4种代谢产物的方法，其特征在于所述步骤1)中茶汤样品提取净化具体包括：干茶按照茶/水比例1/50v/v，水温100℃，冲泡5min后，双层滤纸过滤，得到茶汤样品；取20ml茶汤置于50ml聚四氟乙烯离心管，加入20ml 1％甲酸乙腈溶液，涡旋，加入8.0gnacl，涡旋，振荡5min，以10000r/min转速离心5min；分层后，转移全部上清，重复提取1次，合并上清液并涡旋混匀，取20ml上清于40℃下水浴旋转蒸发浓缩至干，乙腈定容至1.5ml，过0.22μm有机滤膜，uplc-ms/ms测定。

4.如权利要求1所述的一种基于超高效液相色谱串联质谱法测定茶叶和茶汤中唑虫酰胺4种代谢产物的方法，其特征在于所述步骤2)中色谱条件为：acquity uplc hss t3色谱柱规格100mm×2.1mm，1.8μm，柱温40℃，流速0.2ml/min，进样量5μl；流动相a为0.1％甲酸甲醇，b为0.1％甲酸水溶液；梯度洗脱程序为：10％-65％a，0-1.5min；65％-85％a，1.5-5.0min；85％-99％a，5.0-7.5min；99％-100％a，7.5-9min；100％a，9-9.8min，100％-90％a，9.8-10.3min。

5.如权利要求1所述的一种基于超高效液相色谱串联质谱法测定茶叶和茶汤中唑虫酰胺4种代谢产物的方法，其特征在于所述步骤2)中质谱条件为：电喷雾正电离/负电离多反应监测模式；电喷雾毛细管电压3.5kv；离子源温度150℃；脱溶剂气n2温度350℃，流速为650l/hr；锥孔反吹气n2流速为50l/hr；碰撞气ar流速0.25ml/min。

技术总结
一种基于超高效液相色谱串联质谱法测定茶叶和茶汤中唑虫酰胺4种代谢产物的方法，属于茶叶农药残留检测技术领域。本发明包括：1)样品提取净化：对茶鲜叶或茶叶样品，1％甲酸乙腈提取，C<subgt;18</subgt;、MgSO<subgt;4</subgt;、GCB和C<subgt;NT</subgt;‑OH分散固相萃取净化，浓缩后乙腈定容；或1)对茶汤样品1％甲酸乙腈提取，浓缩后乙腈定容；2)采用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱分离，超高相液相色谱‑串联质谱检测唑虫酰胺4种代谢产物；3)计算唑虫酰胺代谢产物标准曲线、线性相关系数和基质效应；5)计算添加回收率、相对标准偏差、方法的检出限和定量限。本发明方法满足残留分析要求，能够为茶鲜叶、茶叶和茶汤中唑虫酰胺4种代谢产物的研究检测提供分析方法。

技术研发人员：王新茹,王紫晗,罗逢健,张新忠,周利,陈宗懋
受保护的技术使用者：中国农业科学院茶叶研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13