一种基于患者恶性积液来源的PTC辅助鉴定NSCLC患者PD-L1表达的方法与流程

本发明涉及生物，具体涉及一种辅助鉴定nsclc患者恶性积液pd-l1表达的方法。

背景技术：

1、pd-1是位于细胞膜上的一个跨膜蛋白，在t淋巴细胞(t-lymphocyte)、b淋巴细胞(b-lymphocyte)等免疫细胞以及肿瘤细胞中表达，当肿瘤细胞膜上的pd-l1与免疫细胞膜上的pd-1结合时，就产生了抑制性信号，这种抑制性信号就能使免疫细胞不能识别肿瘤细胞，也就抑制了免疫系统对肿瘤组织的杀伤作用，导致肿瘤组织的增殖和侵袭不受免疫系统的控制，从而实现免疫逃逸。免疫检查点抑制剂，是一类可以与pd-1或pd-l1结合，阻断肿瘤细胞对免疫细胞的抑制性信号，恢复免疫细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤，使得免疫系统能正常的对肿瘤组织进行清除和杀伤。pd-l1高表达的肿瘤组织，对免疫检查点抑制剂的治疗更加敏感，因此，在进行免疫治疗之前，需要对患者的组织标本进行pd-l1检测。尽管免疫组织化学(immunohistochemistry，ihc)检测pd-l1表达水平可作为一种免疫治疗的预测标志物，用于筛选潜在获益人群和预测疗效，但pd-l1检测实践和结果仍存在很多问题，对于部分无法获取手术组织的患者，采用恶性积液进行pd-l1检测，结果的准确性较组织标本存在差异。因此，利用ptc技术构建nsclc患者恶性积液来源的ptc肿瘤微球，可为恶性积液pd-l1检测等问题提供一个新的解决路径。

2、ptc是一种全新的基于患者来源的原代肿瘤细胞体外培养方法(patient-derivedtumor-like cell clusters，ptc)。ptc是肿瘤细胞、原发性上皮细胞、间质细胞、成纤维细胞和免疫细胞自组装并且增殖的结果，通过获取患者恶性积液，在体外一系列培养后自组装形成肿瘤微球。ptc自组装周期短，3-6天可完成细胞与细胞之间的自聚过程，一定程度上模拟了肿瘤微环境，真实的反映了肿瘤在体内的情况，反应了肿瘤的异质性，与相应肿瘤组织在病理、遗传、功能上有高度明显的一致性。本发明以ptc技术为基础，利用ptc构建基于nsclc患者恶性积液来源的ptc肿瘤微球，检测ptc肿瘤微球pd-l1表达水平，为这部分nsclc患者提供接受免疫治疗的可行性。

技术实现思路

1、本发明提供了一种基于患者恶性积液来源的ptc辅助鉴定nsclc患者pd-l1表达的方法，该方法为仅能提供恶性积液的nsclc患者提供pd-l1检测。

2、本发明的技术方案：

3、步骤一，构建源于nsclc患者恶性积液的ptc模型

4、步骤二，基于ptc模型的培养结果，收集肿瘤微球并制作成石蜡切片

5、步骤三，基于ptc石蜡切片，免疫组化法鉴定pd-l1表达。

6、进一步地，步骤一中构建构建源于nsclc患者恶性积液的ptc模型的具体方法包括如下步骤：

7、1.1将新鲜的源于nsclc患者的恶性积液离心，pbs吹洗后再次离心；

8、1.2 pbs重悬1.1沉淀，平置缓慢加入到细胞分离液中，比例为1∶1，2500r离心20mm；

9、1.3吸取1.2离心管中间层液体，2000r离心5min，弃去上清后，用nsclc专用ptc培养基重悬沉淀，接种到低吸附孔板中，获得源于nsclc患者的ptc模型。

10、进一步地，步骤二中基于ptc模型的培养结果，收集肿瘤微球并制作成石蜡切片的具体方法包括如下步骤：

11、1.1离心收集培养后的微肿瘤ptc，弃去上清并用4％多聚甲醛固定；

12、1.2将步骤1.1中固定好的微肿瘤ptc采用梯度酒精逐级脱水，再用二甲苯进行透化，最后加入石蜡进行渗透包埋；

13、1.3将1.2中包埋后的石蜡块切片并烤片，获得ptc模型的石蜡切片。

14、进一步地，步骤三中鉴定ptc模型石蜡切片pd-l1表达的具体方法包括如下步骤：

15、1.1将切片放到60℃烤箱中烤片2-3小时，逐级经过二甲苯和梯度酒精，将石蜡切片脱蜡至水；

16、1.2将步骤1.1中脱蜡后的切片用3％h2o2室温孵育10min以阻断内源过氧化氢酶，pbs冲洗三次；

17、1.3将步骤1.2中的切片加入到0.01m枸橼酸修复液(ph 6.0)中，微波炉中火加热5min，重复两次，冷却至室温后用pbs冲洗三次；

18、1.4将步骤1.3中的切片用10％正常山羊血清封闭1h，吸去血清后加入pd-l1一抗(22c3，dako)，4℃过夜，pbs清洗两次；

19、1.5在步骤1.4中的切片上滴加二抗孵育30min，pbs清洗两次；

20、1.6在步骤1.5中的切片上滴加dab显色，镜下控制显色时间，pbs清洗三次；

21、1.7在步骤1.6中的切片上滴加苏木素复染，1min后自来水冲洗，1％盐酸分化3s，自来水冲洗；

22、1.8将步骤1.7中染色后的切片依次放入梯度酒精和二甲苯中，每一级时间5min；

23、1.9在步骤1.7中的切片上滴加中性树脂封片，镜检。

技术特征：

1.一种基于患者恶性积液来源的肿瘤样细胞簇(patient-derived tumor-like cellcluster，ptc)辅助鉴定非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，nsclc)患者pd-l1表达的方法，其中，所述辅助鉴定nsclc患者pd-l1表达的方法仅包括基于ptc进行鉴定。其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤一中的可供实验标本，包括但不限于恶性积液。

3.根据权利要求1或2所述的ptc构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤二中的石蜡切片，包括以下步骤：

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤三中的免疫组化，所用的抗体为22c3，检测的平台为dako autostainer link 48平台，评分方式为tps。

技术总结
本发明提供了一种基于患者恶性积液来源的肿瘤样细胞簇(patient‑derived tumor‑like cell cluster，PTC)辅助鉴定非小细胞肺癌(Non‑small cell lung cancer，NSCLC)患者PD‑L1表达的方法。PTC是肿瘤细胞、原发性上皮细胞、间质细胞、成纤维细胞和免疫细胞自组装并且增殖的结果，能利用恶性积液在较短时间内培养成肿瘤微球，获得的肿瘤微球与原始肿瘤具有高度一致性。利用NCSLS患者恶性积液来源的PTC，能为无法获取组织切片的患者提供PD‑L1检测，为这部分患者提供接受免疫治疗的可行性。

技术研发人员：路威,张宇翔,孙志学
受保护的技术使用者：浙江基石精准医学有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15