抗虫蛋白Cry1F胶体金免疫层析速测试纸条及其使用方法

本发明涉及生物工程领域，具体涉及到一种用于转基因玉米抗虫蛋白cry1f胶体金免疫层析速测试纸条及其使用方法。

背景技术：

1、苏云金杆菌(bacillus thuringiensis，bt)是一种广泛存在的革兰氏阳性菌，该菌分泌的抗虫晶体蛋白是目前主要的生物农药；分泌的抗虫蛋白按照氨基酸序列相似性被分为两类：cry和cryδ-内毒素。其中cry蛋白对多种有害昆虫(如鳞翅目，双翅目，鞘翅目，线虫类和原生生物等)幼虫具有毒性。cry毒素已经被转入多种农作物使其具有抗虫性。cry1f蛋白是cry毒素中的一种。目前转cry基因的农作物主要有玉米、土豆、水稻、棉花等。

2、转基因技术的发展与进步推动了生物学的发展。转基因食品虽然能够满足人们对产量、抗虫性等方面的要求，但同时也对人类的生活带来了一些潜在的威胁，如某些基因导入宿主之后会使食品产生毒性，转基因食物产生过敏原，使人产生抗药性，食品的营养价值发生改变等。在进行转基因食品研究开发和商业化的同时，为了对转基因食品的安全性给予综合评估，使消费者能够快速区分转基因食品与天然食品，建立合适的方法对转基因食品中转基因成分进行鉴定与检测，能够促进农业转基因生物安全管理，保障人和动物以及微生物的安全，同时能够保护生态环境，促进农业转基因生物技术的进一步研究。为了对转基因作物或者其衍生物中cry 1f蛋白进行快速的定性分析，研究开发cry 1f胶体金免疫层析速测试纸条具有非常大的意义。免疫胶体金技术(immune colloidal gold technique)是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸(haucl4)在还原剂如抗坏血酸、柠檬酸钠等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金标记技术是免疫层析快速诊断的核心技术，它以胶体金作为示踪标记物应用于抗原抗体反应，其实质是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种用于转基因玉米抗虫蛋白cry 1f的胶体金免疫层析速测试纸条及其使用方法，从而适用于转基因玉米及其产品中抗虫蛋白cry 1f的现场快速检测以及安全性评价。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种胶体金免疫层析速测试纸条所述试纸条包括底板以及粘着在底板上依次相连的样品垫、金标垫、反应膜和吸水垫，其特征在于，样品垫、金标垫、反应膜和吸水垫顺次由底板一端向底板另一端设置，所述金标垫包被抗虫蛋白cry1f单克隆抗体-胶体金结合物。

3、上述胶体金免疫层析速测试纸条在另一种实施方式中，所述样品垫与金标垫相邻端、金标垫与反应膜相邻端以及反应膜与吸水垫相邻端重叠，重叠部分宽度均为1-2mm，所述样品垫与金标垫相邻端为样品垫叠放在金标垫上，所述金标垫与反应膜相邻端为金标垫叠放在反应膜上，所述反应膜与吸水垫相邻端为吸水垫叠放在反应膜上。

4、上述胶体金免疫层析速测试纸条在另一种实施方式中，抗虫蛋白cry 1f单克隆抗体由保藏号为cgmcc no.45009的杂交瘤细胞株1f7 1d8分泌得到。

5、上述胶体金免疫层析速测试纸条在另一种实施方式中，反应膜上设有包被抗虫蛋白cry 1f单克隆抗体的检测线和包被羊抗鼠igg的质控线。

6、上述胶体金免疫层析速测试纸条在另一种实施方式中，反应膜上设有的包被抗虫蛋白cry 1f单克隆抗体由保藏号为cgmcc no.45008的杂交瘤细胞株1d7 1c6分泌得到。

7、上述胶体金免疫层析速测试纸条在另一种实施方式中，检测线和质控线间隔0.5-1.0cm。

8、上述胶体金免疫层析速测试纸条在另一种实施方式中，所述反应膜为硝酸纤维素膜，所述样品垫由玻璃纤维膜或滤纸制成，所述吸水垫由滤纸制成。

9、本发明还提供了上述胶体金免疫层析速测试纸条的检测方法：包括以下步骤：

10、待测样品前处理：若待测样品为植物组织提取液等液体物质时，可直接取40-60μl待测样品检测，若待测样品为植物叶片、茎干、种子等非液体物质时，则需要将待测样品90-110mg磨碎，加入0.5-1.5ml样品处理液充分混匀，冰上静置25-35min后取上清40-60μl检测；

11、表1样品处理液配方

12、

13、

14、2)检测：将试纸条浸入待测样品内，室温下作用5-10min，然后观察结果；

15、3)检测结果分析：

16、阳性：质控线、检测线均呈现条带，说明待测样本中有cry 1f蛋白存在；

17、阴性：检测线不出现条带，质控线呈现条带，说明待测样本中没有cry 1f蛋白存在；

18、失效：如果检测线、质控线均不出现条带或仅有检测线出现条带，说明试纸条失效。

19、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本申请通过设计一种用于转基因玉米抗虫蛋白cry 1f胶体金免疫层析速测试纸条，该试纸条特异性强，灵敏度高，并且，操作简便、快速、准确，适用于转基因玉米及其产品中抗虫蛋白cry 1f的现场快速检测以及安全性评价。

20、保藏信息

21、本发明所涉及的cry1fa单抗杂交瘤细胞株1f7 1d8和cry1fa单抗杂交瘤细胞株1d7 1c6，已依次于2021年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。邮编：100101，保藏编号依次为cgmccno.45009和cgmcc no.45008。

技术特征：

1.一种抗虫蛋白cry 1f胶体金免疫层析速测试纸条，包括底板(1)，其特征在于：所述底板上沿着样品流动方向依次为样品垫(2)、金标垫(3)、反应膜(6)、吸水垫(7)，所述反应膜(6)上设有检测线(4)和质控线(5)，所述金标垫包被抗虫蛋白cry 1f单克隆抗体-胶体金结合物。

2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述样品垫(2)与金标垫(3)相邻端、金标垫(3)与反应膜(6)相邻端以及反应膜(6)与吸水垫(7)相邻端重叠，重叠部分宽度均为1-2mm，所述样品垫(2)与金标垫(3)相邻端为样品垫(2)叠放在金标垫上，所述金标垫(3)与反应膜(6)相邻端为金标垫(3)叠放在反应膜(6)上，所述反应膜(6)与吸水垫(7)相邻端为吸水垫(7)叠放在反应膜(6)上。

3.根据权利要求1或2所述的试纸条，其特征在于，抗虫蛋白cry 1f单克隆抗体由保藏号为cgmcc no.45009的杂交瘤细胞株1f7 1d8分泌得到。

4.根据权利要求1或2所述的试纸条，其特征在于，反应膜上设有包被抗虫蛋白cry 1f单克隆抗体的检测线(4)和包被羊抗鼠igg的质控线(5)。

5.根据权利要求4所述的试纸条，其特征在于，反应膜上设有的包被抗虫蛋白cry 1f单克隆抗体由保藏号为cgmcc no.45008的杂交瘤细胞株1d7 1c6分泌得到。

6.根据权利要求4所述的试纸条，其特征在于，检测线和质控线间隔0.5-1.0cm。

7.根据权利要求1或2所述的试纸条，其特征在于，所述反应膜为硝酸纤维素膜，所述样品垫由玻璃纤维膜或滤纸制成，所述吸水垫由滤纸制成。

8.根据权利要求1或2所述的试纸条的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，其中，样品处理液的配方为：1m tris,ph 7.5 500ul，1m nacl 1.5ml，0.5m edta 20ul，50％甘油2ml，10％sds 1ml，用双蒸水配成10ml，使用时添加1片蛋白酶抑制剂以及50ul的1mm苯甲基磺酰氟。

技术总结
本发明提供了一种胶体金免疫层析速测试纸条，所述试纸条包括底板以及粘着在底板上依次相连的样品垫、金标垫、反应膜和吸水垫，所述金标垫包被抗虫蛋白Cry 1F单克隆抗体‑胶体金结合物，该试纸条特异性强，灵敏度高，并且，操作简便、快速、准确，适用于转基因玉米及其产品中抗虫蛋白Cry 1F的现场快速检测以及安全性评价。

技术研发人员：刘卫晓,金芜军,王磊,宛煜嵩,苗朝华,董美,高进,王迪,孟丽霞,赵伟玲,文婷婷,王占超,陶然
受保护的技术使用者：中国农业科学院生物技术研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12