一种生物标志物组合及其筛选方法和应用与流程

本发明涉及生物标志物，具体涉及一种生物标志物组合及其筛选方法和应用。

背景技术：

0、技术背景

1、目前糖尿病肾病的诊断主要根据尿微量白蛋白和肾小球滤过率。病理诊断为糖尿病肾病的金标准，病因难以鉴别时行肾穿刺病理检查，但不推荐糖尿病患者常规行肾穿刺活检。

2、尿白蛋白漏诊率、误诊率高。2型dkd发生肾损害患者中14-60％没有出现蛋白尿，而出现微量蛋白尿的糖尿病患者中约60％在15年内没有发生肾损害。因此，寻找一种更方便、可靠地指示dkd的标记物，为患者治疗赢得宝贵时间，对dkd防治具有重要性意义。

技术实现思路

1、针对上述存在的拘束局限性，本发明提出了一种生物标志物组合及其筛选方法和应用；其克服了背景技术中提到的不足和缺陷。

2、为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

3、本发明的发明点是提供了一种生物标志物组合，所述生物标志物组合包含有以下化合物中的任意一种或多种：鹅脱氧胆酸、7-氧-胆固醇、前列腺素d2、前列腺素b2、d-葡糖醛酸内酯、吲哚-2-甲酸、七丙二醇、顺-9-棕榈油酸。

4、可选地，上述的一种生物标志物组合，所述生物标志物为血清标志物。

5、本发明的第二个发明点是提供了上述的一种生物标志物组合的筛选方法，包括以下步骤：

6、s1.建立动物模型并收集血清样本；

7、s2.对步骤s1得到的血清样本进行去除高丰度蛋白的前处理，得到血清上清液；

8、s3.采用高效液相色谱和串联质谱联用技术，对步骤s2得到的血清上清液进行分离分析；

9、s4.对液相色谱和质谱联用得到的数据进行整理分析，最终绘制受试者工作特征曲线。

10、可选地，上述的筛选方法，所述步骤s1中所采用的动物模型为大鼠模型，血清样本的收集是在大鼠空腹血糖水平＞16.7mmol/l时，腹主动脉取血，静置、离心取上清。

11、可选地，上述的筛选方法，所述步骤s2中，去除血清样本中高丰度蛋白的前处理方法为：采用体积比甲醇：乙腈为1：1的提取液孵化后离心，取上清液，上清液干燥得到干燥提取物，干燥提取物再加体积比乙腈：水为1：1的提取液复溶，之后再次离心即得到去除高丰度蛋白的血清上清液。

12、可选地，上述的筛选方法，所述步骤s3中，高效液相色谱中，色谱柱规格为1.7μm，2.1mm*100mm，流动相分别为水和乙腈，按洗脱梯度洗脱；质谱条件为电喷离子源温度650℃，质谱电压正离子5500v，负离子-4500v，去簇电压60v，离子源气体中气体1为60psi，气体2为60psi，气帘气为30psi。

13、可选地，上述的筛选方法，所述步骤s4中，数据整理包括但不限于删除在实验样本中缺失超过80％或在qc样本中缺失超过50％的离子数据，对缺失值通过最小值二分之一法进行模拟；利用每个样本的总离子流进行数据的归一化，排除相对标准偏差>30％的数值。

14、可选地，上述的筛选方法，所述步骤s4中，数据分析包括但不限于代谢物注释分析、正交偏最小二乘判别分析、学生t检验分析、斯皮尔曼等级相关性分析以及受试者工作特征曲线分析；

15、代谢物注释分析采用kegg数据库、hmdb数据库、metlin数据库、cas数据库、pubchem数据库和chebl数据库对代谢物进行注释；

16、正交偏最小二乘判别分析是采用偏最小二乘回归建立代谢物表达量和样品类别之间的关系模型实现对样品类别的建模预测并最大程度地反映分类组别之间的差异；

17、学生t检验分析是采用单变量统计分析方法对代谢物水平的独立变化进行统计分析，以降低假阳性；

18、斯皮尔曼等级相关性分析是将所得的差异代谢物与疾病相关的基础参数进行相关性分析，以进一步筛选潜在的生物标志物；

19、受试者工作特征曲线分析是指根据代谢物的水平，绘制受试者工作特征曲线，计算二项精确置信空间，分析潜在的生物标志物的诊断效能。

20、本发明的第三个发明点是提供了上述的生物标志物组合、上述的筛选方法筛选得到的生物标志物组合在制备诊断个体是否是糖尿病并发症试剂中的应用。

21、可选地，上述的应用，所述糖尿病并发症为糖尿病肾病。

22、与现有技术相对比，本发明具有以下优点：

23、本发明所提供的生物标志物组合及其筛选方法和应用，含有此种生物标志物组合的制剂，在诊断个体是否是糖尿病肾病过程中，准确率高，错漏率低，对个体样本伤害小；其筛选方法综合了多种分析方法，筛选效果优于现有方法。

技术特征：

1.一种生物标志物组合，其特征在于，所述生物标志物组合包含有以下化合物中的任意一种或多种：鹅脱氧胆酸、7-氧-胆固醇、前列腺素d2、前列腺素b2、d-葡糖醛酸内酯、吲哚-2-甲酸、七丙二醇、顺-9-棕榈油酸。

2.根据权利要求1所述的一种生物标志物组合，其特征在于，所述生物标志物为血清标志物。

3.权利要求1或2所述的一种生物标志物组合的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤s1中所采用的动物模型为大鼠模型，血清样本的收集是在大鼠空腹血糖水平＞16.7mmol/l时，腹主动脉取血，静置、离心取上清。

5.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤s2中，去除血清样本中高丰度蛋白的前处理方法为：采用体积比甲醇：乙腈为1：1的提取液孵化后离心，取上清液，上清液干燥得到干燥提取物，干燥提取物再加体积比乙腈：水为1：1的提取液复溶，之后再次离心即得到去除高丰度蛋白的血清上清液。

6.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤s3中，高效液相色谱中，色谱柱规格为1.7μm，2.1mm*100mm，流动相分别为水和乙腈，按洗脱梯度洗脱；质谱条件为电喷离子源温度650℃，质谱电压正离子5500v，负离子-4500v，去簇电压60v，离子源气体中气体1为60psi，气体2为60psi，气帘气为30psi。

7.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤s4中，数据整理包括但不限于删除在实验样本中缺失超过80%或在qc样本中缺失超过50%的离子数据，对缺失值通过最小值二分之一法进行模拟；利用每个样本的总离子流进行数据的归一化，排除相对标准偏差>30%的数值。

8.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤s4中，数据分析包括但不限于代谢物注释分析、正交偏最小二乘判别分析、学生t检验分析、斯皮尔曼等级相关性分析以及受试者工作特征曲线分析；

9.权利要求1或2所述的生物标志物组合、权利要求3-8任一所述的筛选方法筛选得到的生物标志物组合在制备诊断个体是否是糖尿病并发症试剂中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述糖尿病并发症为糖尿病肾病。

技术总结
本发明提供了一种生物标志物组合，所述生物标志物组合包含有以下化合物中的任意一种或多种：鹅脱氧胆酸、7‑氧‑胆固醇、前列腺素D2、前列腺素B2、D‑葡糖醛酸内酯、吲哚‑2‑甲酸、七丙二醇、顺‑9‑棕榈油酸；并提供了其制备方法和应用。本发明所提供的生物标志物组合及其筛选方法和应用，含有此种生物标志物组合的制剂，在诊断个体是否是糖尿病肾病过程中，准确率高，错漏率低，对个体样本伤害小；其筛选方法综合了多种分析方法，筛选效果优于现有方法。

技术研发人员：赵婷婷,张波,严美花,武曦霭,李平
受保护的技术使用者：中日友好医院（中日友好临床医学研究所）
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13