细胞培养液中葡萄糖含量的测定方法与流程

本申请属于葡萄糖含量检测，涉及一种细胞培养液中葡萄糖含量的测定方法，该方法还适用于无机化合物、有机化合物及有机高分子化合物、于药物化合物的葡萄糖含量测定。

背景技术：

1、葡萄糖是细胞的能量来源，是新陈代谢的中间产物，是生物体的主要能量来源。特定细胞如胚胎细胞发育营养早期，葡萄糖是进入细胞的作用，是可以提供最基本的能量来源。

2、现有技术提供的细胞培养液多作为商品化试剂，按相应法规的要求在其出厂前需要对该细胞培养液的主要组分包括葡萄糖进行含量测定，以保证其实际使用过程的安全性和有效性。

3、生殖用细胞培养液中成份多而复杂，且各种组分多以微量存在。而食品、生物、医药等行业中，针对葡萄糖的含量测定方法也多种多样，其中就有标准gb5009.8-2016《食品安全国家标准食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定》，该标准提供了液相色谱法对葡萄糖进行定量的分析，该方法与行业的其他类型葡萄糖检测方法大同小异，均以乙腈-水为流动相，采用氨基色谱柱进行分离，通过示差检测器(rid)采集信号进行分析。但其缺点是基线噪音大，平衡久，检出限过高(大多高于2mg/ml)，不适合微量成份＜2mg/ml的检验。因此，急需开发一个易于平衡且适合于微量成份检验的液相色谱法以测定细胞培养液中的葡萄糖含量。

技术实现思路

1、本申请的目的是提供一种细胞培养液中葡萄糖含量的测定方法，采用高效液相色谱法进行测定，流动相为水系状态，系统易于平衡，基线稳定噪声小，定量浓度低，具有良好的稳定性、可靠性及准确度，且操作简便。

2、为实现上述目的，本申请采用的技术方案是：

3、本申请的技术方案是一种细胞培养液中葡萄糖含量的测定方法，包括如下的步骤：

4、配制硫酸溶液作为高效液相色谱仪的流动相；

5、取适宜数量的葡萄糖对照品，用超纯水定容至适宜的浓度后以作为对照品储备液，取适宜体积的对照品储备液进行梯度浓度稀释，得到多个不同浓度的线性测试液；

6、取细胞培养液适量且经微孔滤膜过滤作为供试品溶液；

7、将各个线性测试液、及供试品溶液分别在相同色谱条件下引入高效液相色谱仪，得到各个线性测试液的色谱图及供试品溶液的色谱图；

8、采用外标法将各个线性测试液的浓度与各个线性测试液的色谱图的峰面积绘制成标准工作曲线，得到线性公式(1)：

9、y标＝a x标+b       (1)

10、其中，y标为线性测试液的色谱图的峰面积，x标为线性测试液的浓度，a为斜率，b为截距；

11、将得到的供试品溶液的色谱图的峰面积代入上述公式(1)的y标，即可计算出供试品溶液中葡萄糖的浓度。

12、本技术方案的有益效果是，硫酸溶液可有效分离到葡萄糖，配制方法简单可行，易于操作；采用数量级浓度关系来标定、分析检测结果，具有高精确度和高可行度；葡萄糖为单糖，是一种多羟基醛，在硫酸溶液中，具有很好的洗脱和保留能力，通过有机酸分析专用柱可获得很好分离效果；方法的抗干扰能力强，分别往流动相中加入5％乙腈和1％异丙醇进行试验，葡萄糖的色谱峰依旧具有良好的对称性和分离度。

13、在该技术方案的实施方式中，所述色谱条件为使用流动相在20℃-40℃下洗脱40min-60min，设置流动相的流速为0.1-0.6ml/min，梯度洗脱，在示差检测器30-35℃条件下测定，记录色谱图。

14、经试验确认后提供较佳的色谱条件，能够最大限度分离到葡萄糖，具有高回收率、高纯度的优势。

15、在该技术方案的实施方式中，优选的色谱条件为通过自动进样器引入10μl到高效液相色谱仪，通过色谱柱分离后，使用流动相在35℃下洗脱60min，设置流动相的流速为0.6ml/min，梯度洗脱，在示差检测器35℃条件下测定，记录色谱图。

16、在该技术方案的实施方式中，所述色谱柱采用型号为aminex hpx-87h的有机酸和和醇分析柱，其固定相为磺化聚苯乙烯二乙烯苯树脂，树脂离子型为氢型，有机酸和醇分析专用柱可获得很好分离效果。

17、在该技术方案的实施方式中，“将各个线性测试液、及供试品溶液分别在相同色谱条件下引入高效液相色谱仪”具体是包括：

18、将各个线性测试液按照浓度从低至高依次在相同色谱条件下引入高效液相色谱仪一次；

19、将供试品溶液在相同色谱条件下重复引入高效液相色谱仪至少一次。可以是多次，可取多次的平均值，优选为两次，

20、在该技术方案的实施方式中，所述葡萄糖对照品的纯度级别为色谱级。

21、在该技术方案的实施方式中，所述照品储备液的浓度为5.0mg/ml，线性测试液的数量为五个，各个线性测试液的梯度浓度依次为0.025mg/ml，0.05mg/ml，0.1mg/ml，0.5mg/ml和1mg/ml。

22、在该技术方案的实施方式中，所述照品储备液的浓度为5.0mg/ml，线性测试液的数量为五个，各个线性测试液的梯度浓度依次为0.25mg/ml，0.5mg/ml，1mg/ml，2.5mg/ml和5mg/ml。

23、在该技术方案的实施方式中，流动相的配制为：精密量取硫酸至烧杯中，加入超纯水，玻璃棒搅拌均匀，再用0.45μm的水系滤膜过滤，超声波振动15min，配制浓度为0.002-0.005mol/l的硫酸溶液。硫酸溶液配制量可根据实际实际情况按比例配制。

24、在该技术方案的实施方式中，所述细胞培养液经0.22μm微孔滤膜过滤后即得供试品溶液。

25、本技术方案的测定方法以0.002-0.005mol/l硫酸溶液为流动相，采用aminexhpx-87h色谱柱分离，通过示差检测器(rid)采集信号进行分析，流动相为水系状态，系统易于平衡，基线稳定、噪声小，方法最低定量浓度为0.025mg/ml，方法具有良好的稳定性、可靠性及准确度，且操作简便。

技术特征：

1.细胞培养液中葡萄糖含量的测定方法，其特征在于，包括如下的步骤：

2.根据权利要求1所述的细胞培养液中葡萄糖含量的测定方法，其特征在于，所述色谱条件为使用流动相在20℃-40℃下洗脱40min-60min，设置流动相的流速为0.1-0.6ml/min，梯度洗脱，在示差检测器30-35℃条件下测定，记录色谱图。

3.根据权利要求2所述的细胞培养液中葡萄糖含量的测定方法，其特征在于，优选的色谱条件为通过自动进样器引入10μl到高效液相色谱仪，通过色谱柱分离后，使用流动相在35℃下洗脱60min，设置流动相的流速为0.6ml/min，梯度洗脱，在示差检测器35℃条件下测定，记录色谱图。

4.根据权利要求3所述的细胞培养液中葡萄糖含量的测定方法，其特征在于，所述色谱柱采用型号为aminex hpx-87h的有机酸和和醇分析柱。

5.根据权利要求1所述的细胞培养液中葡萄糖含量的测定方法，其特征在于，“将各个线性测试液、及供试品溶液分别在相同色谱条件下引入高效液相色谱仪”具体是包括：

6.根据权利要求1所述的细胞培养液中葡萄糖含量的测定方法，其特征在于，所述葡萄糖对照品的纯度级别为色谱级。

7.根据权利要求1所述的细胞培养液中葡萄糖含量的测定方法，其特征在于，所述照品储备液的浓度为5.0mg/ml，线性测试液的数量为五个，各个线性测试液的梯度浓度依次为0.025mg/ml，0.05mg/ml，0.1mg/ml，0.5mg/ml和1mg/ml。

8.根据权利要求1所述的细胞培养液中葡萄糖含量的测定方法，其特征在于，所述照品储备液的浓度为5.0mg/ml，线性测试液的数量为五个，各个线性测试液的梯度浓度依次为0.25mg/ml，0.5mg/ml，1mg/ml，2.5mg/ml和5mg/ml。

9.根据权利要求1所述的细胞培养液中葡萄糖含量的测定方法，其特征在于，流动相的配制为：精密量取硫酸至烧杯中，加入超纯水，玻璃棒搅拌均匀，再用0.45μm的水系滤膜过滤，超声波振动15min，配制浓度为0.002-0.005mol/l的硫酸溶液。

10.根据权利要求1所述的细胞培养液中葡萄糖含量的测定方法，其特征在于：所述细胞培养液经0.22μm微孔滤膜过滤后即得供试品溶液。

技术总结
本申请涉及细胞培养液中葡萄糖含量的测定方法，包括如下的步骤：配制硫酸溶液作为流动相；取葡萄糖对照品用超纯水定容至适宜的浓度后以作为对照品储备液，取适宜体积的对照品储备液进行梯度浓度稀释，得到多个不同浓度的线性测试液；取细胞培养液适量且经微孔滤膜过滤作为供试品溶液；将各个线性测试液、及供试品溶液分别在相同色谱条件下引入高效液相色谱仪，得到各个线性测试液的色谱图及供试品溶液的色谱图；采用外标法将各个线性测试液的浓度与各个线性测试液的色谱图的峰面积绘制成标准工作曲线，得到线性公式，将得到的供试品溶液的色谱图的峰面积代入公式，即可计算出供试品溶液中葡萄糖的浓度。

技术研发人员：请求不公布姓名
受保护的技术使用者：深圳韦拓生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12