一种鉴别天然烟碱和合成烟碱的液相色谱-串联质谱分析方法与流程

本发明属于化学分析，具体涉及鉴别天然烟碱和合成烟碱的液相色谱-串联质谱分析方法。

背景技术：

1、烟碱是烟草制品的重要化学成分，其含量高低与烟的品质和口感密切相关。天然烟碱(>99％(s)-(-)-烟碱)主要来源于烟草植物，例如烤烟和卷烟。随着技术的发展，含有合成烟碱的新型烟草制品已成为传统烟草产品的替代品。合成烟碱与天然烟碱不同，含有等量的两种立体异构体(r,s-(±)-烟碱)，其主要通过化学原料制备。由于天然烟碱不是来源于烟草植物，这便给食品药品监督管理局对烟草制品的监督管理带来了极大的挑战。因此，迫切需要开发一种可靠的方法来识别天然和合成烟碱的来源。

2、目前，基于手性柱的液相色谱-质谱分析是较为常用的烟碱鉴定方法，然而该技术不能鉴别高纯度的天然(s)-(-)-烟碱与合成(s)-(-)-烟碱。近年来，稳定同位素比值技术在人工合成和天然提取的牛磺酸、咖啡因、麻黄碱的鉴定中发挥着重要作用。此外，hu等人基于氢核磁光谱的位点特异性峰强度比分析技术研究了天然与合成烟碱不同(liu b,analbioanal chem，2019,411(24):6427-6434)。然而，这两种方法要求操作者有较高的专业知识，并且实验过程复杂、成本高。

3、化学计量统计分析对于数据的解释和未知来源样品的分类模型构建非常重要。典型的化学计量学数据分析包括无监督的主成分分析、层次聚类分析；以及有监督的线性判别分析、偏最小二乘判别分析、正交偏最小二乘判别分析等。与pls-da相比，opls-da可以滤除与分类信号无关的噪声，提高模型的分析能力和有效性。本研究通过开发基于同位素模式峰的串联质谱技术，结合化学计量学分析手段鉴定天然与合成烟碱的来源，实现市场上合成烟碱的烟草产品的准确识别、标签和监管。

技术实现思路

1、本发明的目的正是基于上述现有技术不足，建立了鉴别天然烟碱和合成烟碱的液相色谱-串联质谱分析方法，首次利用串联质谱的同位素模式区分鉴定烟碱来源，具有操作简单、快速、无需定量等特点。

2、本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

3、一种鉴别天然烟碱和合成烟碱的液相色谱-串联质谱分析方法，首先采用超纯水将烟草中的天然烟碱提取出来，合成烟碱直接使用超纯水稀释；随后进行上样，采用液相色谱将烟碱与萃取液中的其他杂质分开，利用液相色谱-串联质谱检测，其中：通过对比烟碱的[m+h]+和[m+h+1]+峰的丰度和面积比，以及[m+h]+和[m+h+1]+峰作为母离子的碎片峰的同位素丰度比来验证烟碱的来源或天然性；通过结合化学计量学的方法进一步构建天然与合成烟碱鉴别的评价模型，并筛选影响两者差异的主要变量。

4、本发明具体包括以下步骤：

5、(1)烟碱提取：采用超纯水溶液将烟草中的天然烟碱提取出来，并将合成烟碱进行稀释；具体方式为：

6、天然烟碱：准确称取0.01g(精确到0.0001g)的天然烟草制品，加入50ml的超纯水，于30℃下超声萃取20min，静置过夜，取适量的萃取液过0.22μm水系滤膜；

7、合成烟碱：烟碱纯品用水稀释至20μg/ml。

8、(2)采用超高效液相色谱将烟碱和萃取液中的其他杂质分开；

9、液相色谱条件为：流动相a：10mm甲酸铵，ph为3.5的水溶液；流动相b：乙腈。流速：0.4ml/min，洗脱方式：70％ b等度洗脱7min。色谱柱：色谱柱：acquity uplc beh hilic(2.1×150mm,1.7μm，美国waters公司)，柱温为40℃。进样体积为2μl。

10、(3)通过质谱分析，对比烟碱的[m+h]+和[m+h+1]+峰的丰度和面积比，以及[m+h]+和[m+h+1]+峰作为母离子的碎片峰的同位素丰度比来验证烟碱的来源或天然性；

11、质谱条件为：离子源为电喷雾(electrospray ionization，esi)离子源，正离子模式下进行数据采集，碰撞气体为氩气；其毛细管的电压、雾化器气的压力和干燥气的温度分别是-4.5kv、1.8bar和220℃；质谱内标为甲酸钠溶液，m/z范围为50-1300th；随后，分别对烟碱m/z为163和164进行ms/ms碎裂分析，且二级碎裂中碰撞能量(cid)为10ev；m/z为163的碎片离子为84和130，m/z为164的碎片离子为85和131。

12、(4)通过结合化学计量学的方法构建天然与合成烟碱鉴别的opls-da评价模型，并筛选影响两者差异的主要变量；

13、采用opls-da样品分类模型用于计量统计分析，由vip值可以看出变量164-85/84和164-85/(84+85)可以代表天然烟碱样本，而变量163-131/131和163-131/(130+131)代表合成烟碱样本。该模型的总预测准确率为97.87％；天然烟碱预测准确率为95.45％，合成烟碱样本预测准确率为100％。

14、本发明的方法无需复杂的烟碱提取纯化等复杂的样品前处理过程，通过开发基于同位素模式峰的串联质谱技术，结合化学计量学分析手段鉴定天然与合成烟碱的来源，实现市场上合成烟碱的烟草产品的准确识别、标签和监管。

技术特征：

1.一种鉴别天然烟碱和合成烟碱的液相色谱-串联质谱分析方法，首先采用超纯水将烟草中的天然烟碱提取出来，合成烟碱直接使用超纯水稀释；随后进行上样，采用液相色谱将烟碱与萃取液中的其他杂质分开，利用液相色谱-串联质谱检测，其特征在于：通过对比烟碱的[m+h]+和[m+h+1]+峰的丰度和面积比，以及[m+h]+和[m+h+1]+峰作为母离子的碎片峰的同位素丰度比来验证烟碱的来源或天然性；通过结合化学计量学的方法进一步构建天然与合成烟碱鉴别的评价模型，并筛选影响两者差异的主要变量。

2.根据权利要求1所述的鉴别天然烟碱和合成烟碱的液相色谱-串联质谱分析方法，其特征在于：具体步骤如下：

3.根据权利要求2所述的鉴别天然烟碱和合成烟碱的液相色谱-串联质谱分析方法，其特征在于：步骤(1)中的烟碱提取处理方式具体为：

4.根据权利要求2所述的鉴别天然烟碱和合成烟碱的液相色谱-串联质谱分析方法，其特征在于：步骤(2)中的液相色谱条件为：

5.根据权利要求2所述的鉴别天然烟碱和合成烟碱的液相色谱-串联质谱分析方法，其特征在于：步骤(3)中的质谱条件为：

6.根据权利要求2所述的鉴别天然烟碱和合成烟碱的液相色谱-串联质谱分析方法，其特征在于：步骤(4)中的模型具体如下：

技术总结
一种鉴别天然烟碱和合成烟碱的液相色谱‑串联质谱分析方法，其特征在于：天然烟碱采用超纯水溶液将烟草中的烟碱提取出来，合成烟碱使用超纯水稀释，采用液相色谱将烟碱与萃取液中的其他杂质分开，利用液相色谱‑同位素质谱仪HPLC‑MS通过对比烟碱的[M+H]<supgt;+</supgt;和[M+H+1]<supgt;+</supgt;峰的丰度和面积比，以及[M+H]<supgt;+</supgt;和[M+H+1]<supgt;+</supgt;峰作为母离子的碎片峰同位素的丰度比来验证烟碱的来源或天然性。通过结合化学计量学的方法进一步构建天然与合成烟碱鉴别的评价模型，并筛选影响两者差异的主要变量。本发明通过开发基于同位素模式峰的串联质谱技术，结合化学计量学分析手段鉴定天然与合成烟碱的来源，实现市场上合成烟碱的烟草产品的准确识别、标签和监管。

技术研发人员：付亚宁,崔利利,于捧捧,陈欢,王红娟,田雨闪,韩书磊,刘彤,侯宏卫,胡清源
受保护的技术使用者：国家烟草质量监督检验中心
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11