一种叶绿素含量无损测定方法和系统

1.本发明涉及一种叶绿素含量无损测定方法和系统，属于涉及植物光合作用测定技术领域。


背景技术：

2.光合作用是地球上一切生命生存和生长的物质基础。叶绿素是光合作用最重要的色素，是光合作用机构光系统ii(psii)和光系统i(psi)反应中心独具活性的基团，与其他色素分子一起吸收和利用光能进行光合作用。叶绿素含量与植物光合能力密切相关，并进一步影响植物的生长和发育。叶绿素荧光是植物光合作用机构叶绿素分子受光激发后发出的荧光，它不仅包含光合机构结构信息，还反映光合过程动态信息，几乎所有光合作用过程的变化都可以通过叶绿素荧光反映出来。叶绿素荧光技术具有活体测量、简便、快捷、可靠等特性，在国际上得到了广泛的应用。植物叶片的叶绿素含量及其在叶肉组织内的分布直接反映了叶片水平的光能吸收利用和co2固定能力。根据如图1所示的快速荧光动力学曲线即ojip曲线的时间进程，植物在吸收光能的前30us内(o点之前)仅由叶绿素产生很弱的荧光，称为基础荧光产量，其强弱与叶绿素含量相关，之后启动光化学反应，荧光逐渐上升，同时伴随荧光淬灭。因此，o点的荧光产量直接反映了叶绿素含量及其在叶片内部的分布情况。
3.常见的叶绿素含量测定方法大致分为3类：应用最广泛的是溶剂提取法，将叶片用乙醇或者丙酮浸提后，通过比色法测定吸光度，通过公式计算叶绿素含量；其次为光学仪器测定法，使用叶绿素计测定叶片的相对叶绿素含量，如spad-502或cci-200型叶绿素计；第三种为基于光谱数据的估算，利用高光谱仪的遥感数据与溶剂提取法建立关系模型，估算叶绿素含量。溶剂提取法通过提取叶绿体色素进行比色，得到叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量，准确度最高，但是需要破坏性取样，过程繁琐，且提取液易受光氧化而产生测量误差。光学仪器法使用叶绿素计，测定快捷方便，不需要破坏植物样品，但是由于叶片光学性质差异，叶片内部栅栏组织与海绵组织不规则分布及其对光吸收和传递性质不同，以及叶绿素a和叶绿素b比例差异，会造成相同叶绿素含量的不同物种测定结果变异很大。基于光谱数据的测定多用于农业遥感的预测，对于叶片水平的估算误差较大。


技术实现要素：

4.针对上述问题，本发明的目的是提供一种叶绿素含量无损测定方法和系统，其基于叶片横截面叶绿素荧光成像技术与传统的叶绿素含量提取方法建立经验转换模型，并通过不同植物进行验证，实现对任意植物叶绿素含量的无损测定。
5.为实现上述目的，本发明提出了以下技术方案：一种叶绿素含量无损测定方法，包括以下步骤：根据弱光下叶绿素产生的基础荧光与叶绿素含量的相关关系，建立荧光影像和叶绿素含量的经验转换模型，经验转换模型包括待定参数m和参数b；通过测量叶片叶面积和干重计算叶片的比叶重，将比叶重的值作为参数b的值；提取同一叶片的叶绿素溶液，
将叶绿素溶液稀释为不同浓度梯度，采用同一叶片横截面荧光成像装置获取不同浓度梯度的叶绿素溶液的荧光影像，数字化得到基础荧光产量f；将叶绿素溶液的浓度梯度与基础荧光产量f输入经验转换模型进行拟合，获得参数m的值；将待测叶片基础荧光产量f输入确定了待定参数后的经验转换模型，获得待测叶片的叶绿素浓度。
6.进一步，经验转换模型的计算公式为：
7.c＝-lg(1-f/m)/b
8.其中，c为叶绿素含量，f为基础荧光产量；m为仪器特征常数，b为叶片特征常数。
9.进一步，参数b的计算公式为：
[0010][0011]
其中，b为叶片特征常数，叶片特征常数取比叶重的值，m为干重，sl为叶面积。
[0012]
进一步，叶绿素溶液的浓度的计算方法为：通过分光光度计测试叶绿素溶液的吸光度，根据朗伯比尔定律，通过吸光度计算叶绿素溶液的浓度。
[0013]
进一步，不同浓度的叶绿素溶液的荧光影像的测量方法为：将不同浓度梯度的叶绿素溶液放置在叶片横截面荧光成像装置上，采用短脉冲强光照射，得到溶液荧光影像。
[0014]
进一步，短脉冲强光采用波长为400nm-500nm的蓝光激光，光强不小于200000μmol m-2
s-1
，脉冲宽度不大于30us。
[0015]
本发明还公开了一种叶绿素含量无损测定系统，用于上述任一项的叶绿素含量无损测定方法，包括：叶室、激光光源、ccd图像采集装置和数据处理模块；叶室，用于放置叶片；激光光源，用于产生激光，并用产生的激光照射叶绿素溶液和叶片；ccd图像采集装置，用于采集叶绿素溶液和叶片横截面的荧光影像；数据处理模块，用于对采集的荧光影像进行处理，获得基础荧光产量f。
[0016]
进一步，激光光源和ccd图像采集装置之间设置二向分色镜，激光光源产生的激光通过二向分色镜反射叶绿素溶液上或叶片横截面上，叶绿素溶液或叶片横截面产生的荧光通过显微镜物镜到达二向分色镜，并由二向分色镜投射到ccd图像采集装置上。
[0017]
进一步，ccd图像采集装置采用高灵敏度黑白ccd图像采集装置，ccd图像采集装置的前方设置短波截至滤光片，仅采集680-750nm范围内的叶绿素溶液或叶片横截面叶绿素荧光，避免入射光或环境杂散光污染。
[0018]
进一步，数据处理模块将ccd图像采集装置采集的荧光影像转换为灰度图，在灰度图中选取若干个横截面，求每个横截面的像素点的平均值，标准化后即为基础荧光产量f。
[0019]
本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：
[0020]
1、本发明基于叶片横截面叶绿素荧光成像技术与传统的叶绿素含量提取方法建立经验转换模型，并通过不同植物进行验证，实现对任意植物叶绿素含量的无损测定。
[0021]
2、本发明采用高光强短脉冲激光光源，避免荧光淬灭，使得基础荧光产量f测定更加准确，因此能准确估算叶绿素含量。
[0022]
3、本发明基于叶片横截面荧光成像装置，还可以获得植物叶片内部不同叶肉组织光合能力差异和叶绿素分布，实现叶片叶绿素含量和光合性能的关联分析。本发明操作简单、测定可靠，对于植物生理、植物学、生态学等研究领域具有广泛的应用前景。
附图说明
[0023]
图1是快速荧光动力学ojip曲线示意图；
[0024]
图2是本发明一实施例中叶绿素含量无损测定系统的示意图；
[0025]
图3是本发明一实施例中不同梯度溶液叶绿素含量与基础荧光产量f关系示意图；
[0026]
图4是本发明一实施例中不同植物叶绿素溶液估算值和实测值倍数与比叶重关系示意图。
[0027]
附图标记：
[0028]
1-叶室；2-激光光源；3-ccd图像采集装置；4-数据处理模块；5-激光；6-荧光；7-二向分色镜；8-显微镜物镜；9-滤光片。
具体实施方式
[0029]
为了使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，通过具体实施例对本发明进行详细的描绘。然而应当理解，具体实施方式的提供仅为了更好地理解本发明，它们不应该理解成对本发明的限制。在本发明的描述中，需要理解的是，所用到的术语仅仅是用于描述的目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
[0030]
为了解决现有技术中需要破坏性取样，过程繁琐，且提取液易受光氧化而产生测量误差等问题，本发明提出了一种叶绿素含量无损测定方法和系统，选取叶片横截面荧光成像装置，并基于所选取设备的测定参数，建立荧光影像与叶绿素含量的经验转换模型；计算该经验转换模型中的待定参数值，根据获得的参数值与叶绿素含量转换模型，在叶片横截面荧光成像装置上测定任意叶片荧光影像，数字化后获得基础荧光产量f,计算任意叶片叶绿素含量。其基于叶片横截面叶绿素荧光成像技术与传统的叶绿素含量提取方法建立经验转换模型，并通过不同植物进行验证，实现对任意植物叶绿素含量的无损测定。下面结合附图，通过实施例对本发明方案进行详细阐述。
[0031]
实施例一：
[0032]
叶绿素含量和叶片的光合性能有直接的联系，也有一些研究将叶绿素荧光参数与叶绿素含量相关联，从一系列荧光参数中选择相关性最好的某一个或某一组参数作为叶绿素含量的指标，但这些参数都无法排除荧光淬灭，不能准确反映叶绿素含量的真实水平。如果将叶片光合性能和叶绿素含量的测定同步完成，不仅能够实现叶片叶绿素含量无损测定，还能和光合性能进行关联分析，结合叶片水平的光吸收、光合效率及碳同化的非损伤测定，对于深刻理解植物的光响应与适应的生理生态学机制具有非常重要的意义。
[0033]
本实施例中公开了一种叶绿素含量无损测定方法，包括以下步骤：
[0034]
s1根据叶面横截面荧光成像装置的测定参数，建立荧光影像和叶绿素含量的经验转换模型，经验转换模型包括待定参数m和参数b；
[0035]
选取叶面横截面荧光成像装置，并基于所选的叶面横截面荧光成像装置的测定参数，建立荧光f影像和叶绿素含量的经验转换模型，其计算公式为：
[0036]
c＝-lg(1-f/m)/b
[0037]
其中，c为叶绿素含量，f为基础荧光产量；m为仪器特征常数，b为叶片特征常数。其中，参数m和参数b为待测参数。
[0038]
s2通过测量叶片叶面积和干重计算叶片的比叶重，将比叶重的值作为参数b的值。
[0039]
采集新鲜叶片，测量叶片的叶面积，将叶片在65℃下烘干至恒重，称量干重，计算比叶重，得到该经验转换模型的参数b，参数b的计算公式为：
[0040][0041]
其中，b为叶片特征常数，叶片特征常数取比叶重的值，m为干重，sl为叶面积，以垂榕为例，b值为0.52。
[0042]
s3提取同一种植物相同部位叶片的叶绿素溶液，将叶绿素溶液稀释为不同浓度梯度，采用同一叶片横截面荧光成像装置获取不同浓度梯度的叶绿素溶液的荧光影像。
[0043]
提取叶绿素溶液：采取新鲜叶片，剪取0.2g左右新鲜叶片，避开叶脉，测量叶面积后剪碎，加入25ml 95％乙醇，避光放置24小时，浸泡至叶片变白。将浸提完全的叶绿素溶液稀释成不同的浓度梯度(0.025，0.05，0.1，0.2，1v/v)，在分光光度计上测定665nm和649nm处的吸光度，根据公式计算实际的叶绿素含量。计算公式如下：pa＝13.95a
665-6.88a
649
[0044]
pb＝24.96a
649-7.32a
665
[0045]creal
(mg/m
2 fw)＝(pa+pb)*v/ss
[0046]
其中，pa为叶绿素a含量，pb为叶绿素b含量，a665和a649为665nm和649nm处吸光度，v为浸提液体积体积，ss为用于浸提的叶片面积，c
real
是实测叶绿素浓度。
[0047]
将步骤s3中不同浓度梯度的叶绿素溶液放置在叶片横截面荧光成像装置上，采用短脉冲强光照射，得到溶液基础荧光产量f的影像，将比色测得的实际叶绿素含量与基础荧光产量f拟合，得到参数m的值，其具体过程如下：
[0048]
叶绿素溶液的浓度计算方法为：通过分光光度计测试叶绿素溶液的吸光度，根据朗伯比尔定律，通过吸光度计算叶绿素溶液的浓度，其计算公式为：
[0049][0050]
其中，a是吸光度，i0为入射光，i
t
为透射光，ε为消光系数，c是叶绿素浓度，l为光程。
[0051]
一般情况下，植物叶绿素荧光与光能吸收成正比。光能吸收等于入射光i0减去透射光i
t
和反射光ir，反射光在显微镜系统中约占2％，可以忽略不计。测定叶片横截面荧光时，叶片垂直对准镜头，透射光也接近0，因此：
[0052][0053]
假设m
′io
为常数m，εl为常数b，则：
[0054][0055]
由于叶绿素溶液是均一的，消光系数和光程是固定的，但不同物种叶片内部结构不同，叶片厚度、叶绿素排列方式等导致叶片光吸收差异，因此以比叶重作为叶片特征常数b，计算公式为：
[0056]
[0057]
本实施例中优选短脉冲强光采用波长为400nm-500nm的蓝光激光，光强不小于200000μmol m-2
s-1
，脉冲宽度不大于30us。根据占空比计算得到最终照射到叶片平均光强约为1μmol m-2
s-1
，能够避免荧光淬灭，获得稳定的叶绿素溶液的基础荧光产量f。
[0058]
s4将叶绿素溶液的浓度梯度与荧光影像的基础荧光产量f输入经验转换模型进行拟合，获得参数m的值，如图3所示，m为93.79。
[0059]
s5将待测叶片的荧光影像的基础荧光产量f输入确定了待定参数后的经验转换模型，获得待测叶片的叶绿素浓度。
[0060]
实施例二：
[0061]
基于相同的发明构思，本实施例公开了一种叶绿素含量无损测定系统，如图2所示，用于上述任一项的叶绿素含量无损测定方法，包括：叶室1、激光光源2、ccd图像采集装置3和数据处理模块4；
[0062]
叶室1，用于放置叶绿素溶液和叶片，将装有叶绿素溶液的比色皿或叶片放在叶室1的位置，避光放置5分钟；
[0063]
激光光源2，用于产生激光5，并用产生的激光5照射叶绿素溶液；
[0064]
ccd图像采集装置3，用于采集叶绿素溶液的荧光影像；
[0065]
数据处理模块4，用于对采集的荧光影像进行处理，获得基础荧光产量f。本实施例中数据处理模块4优选为计算机或其它具有计算功能的装置。
[0066]
打开ccd图像采集装置3和计算机，设置图像采集装置的参数。本实施例中图像采集装置的参数优选为ccd曝光时间为600ms，增益22.5x，视频拍摄选项设置记录时间为12s。打开激光光源2，ccd图像采集装置3开始采集荧光影像，ccd图像采集装置3记录完成后导出rgb图像序列并保存，生成荧光影像序列。在数据处理模块4中采用matlab软件处理rgb图像序列，将rgb图像序列转换为灰度图，在灰度图中选取若干个横截面，求每个横截面的像素点的平均值，数据标准化后即为叶绿素基础荧光产量f。本实施例中横截面的个数优选为5个。将实际叶绿素含量与基础荧光产量f做曲线，建立叶绿素含量与基础荧光产量f的经验转换模型。拟合得到经验转换模型中的参数m和参数b值。
[0067]
激光光源2和ccd图像采集装置3之间设置二向分色镜7，激光光源2产生的激光5通过二向分色镜7反射叶绿素溶液上，叶绿素溶液产生的荧光6通过显微镜物镜8到达二向分色镜7，并由二向分色镜7投射到ccd图像采集装置3上。数据处理模块4将ccd图像采集装置3采集的荧光影像。
[0068]
本实施例中，ccd图像采集装置3采用高灵敏度黑白ccd图像采集装置3，分辨率不小于1392
×
1040pixel，拍摄速度不小于30fps/s，ccd图像采集装置3的前方设置短波截至滤光片9，仅允许680-750nm范围内的叶绿素荧光6通过，以避免入射光和环境杂散光的干扰。
[0069]
为避免荧光6污染，本实施例中激光光源2采用蓝光激光，波长为450nm
±
50nm，采用高光强短脉冲照射，光强不小于200000μmol m-2
s-1
，光源开启为1μs亮+15ms暗，到达样品平均光强为1μmol m-2
s-1
，避免荧光淬灭引起基础荧光产量f上升，从而获得稳定的f，准确估算叶绿素含量。
[0070]
为保证长工作距离和分辨率，显微镜可以采用倒置荧光显微镜，物镜倍数4x或10x，可以区分叶片内部栅栏组织和海绵组织。
[0071]
为了减少叶片因受切后产生生理活性变化，每个待测样叶片的测定时间在2分钟以内。
[0072]
实施例三：
[0073]
为了对本发明中方法进行验证，本实施例中通过4种不同植物对经验公式的准确性进行验证，具体验证过程为：
[0074]
本实施例中选择温室中4种植物，即选择大叶伞、圆叶镶边南洋森、扶桑和垂榕，采集相同生长部位、相同长势的新鲜叶片各3片，擦干净表面浮尘；
[0075]
取出1片叶片，称量鲜重、测定叶面积，在65℃烘箱中烘干至恒重，计算比叶重，即为b值；
[0076]
取出1片叶片，用湿纱布完全包裹，暗适应20min，用于测横截面叶绿素的荧光6；取出1片叶片，剪去叶脉，称鲜重、测量叶面积，然后剪碎，加入25ml 95％乙醇浸提24h，提取叶绿素溶液，在分光光度计上测定665nm和649nm处的吸光度，根据上述公式计算叶绿素含量c
real
；
[0077]
将暗适应好的叶片切为1cm
×
1cm大小，切好的叶片夹设在遮光海绵中间，遮光海绵预先浸湿，固定在叶室1中，放置在显微镜的载物台上，叶片横截面对准光源，用湿纱布遮盖；
[0078]
打开显微镜、ccd图像采集装置3和数据处理模块4，打开图像采集软件，设置曝光时间、增益、影像采集时间间隔和时长；打开激光光源2，产生高强度短脉冲测量光，调整焦距使叶片内部组织清晰；采集叶片横截面荧光影像(荧光6)视频，导出rgb图像序列，采用matlab软件处理图像，数字化后得到叶片横截面基础荧光产量f；
[0079]
根据经验转换模型计算叶绿素含量c
cal
；
[0080]
重复上述步骤依次测定暗适应好的其余3种植物叶片；
[0081]
以上测定结果如表1所示，本实施例中测定结果和传统方法测定结果基本一致，具有可靠性；证明利用本发明中技术方法和经验公式是可靠的。
[0082]
表1本发明和现有技术的方法获得的4种植物叶片叶绿素含量测定值表
[0083][0084]
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，而未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换，其均应涵盖在本发明的权利要求保护范围之内。上述内容仅为本技术的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本技术揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。因此，本技术的保护范围应以权利要求的保护范围为准。