快速检测小分子化合物与FXR受体结合能力的方法

本发明涉及快速检测小分子化合物与fxr受体结合能力的方法，属于小分子荧光探针检测。

背景技术：

1、fxr受体(胆汁酸受体)属于配体激活转录因子核受体家族成员，具有典型的核受体结构，即氨基末端高度保守的dna结合区(dbd)，羧基末端配体结合区(lbd)，氨基末端配体非依赖性转录激活功能区(af1)，羧基末端配体依赖性转录激活功能区(af2)和脚链区。fxr通过抑制胆酸的合成、结合及转运，调节其代谢，是体内胆酸平衡的主要调节者。

2、研究发现，fxr受体的结构特点使其能够结合构型多样的小分子化合物(比如小分子激动剂)，结合小分子激动剂能够诱导二聚体界面上fxr的螺旋末端发生构象改变，进而影响fxr受体与小分子化合物的直接结合能力。

3、小分子荧光探针作为辅助工具可以用于确定多种小分子与生物大分子的作用模式，这对于新污染物的筛查和药物合理设计等科学研究和探索具有重要意义。例如，以小分子荧光探针作为辅助工具，构建高通量毒性化合物筛查模型，高效快速的确定与靶点作用的新型环境污染物，在分子水平阐明其作用潜力，揭示毒作用机制。此外，以小分子荧光探针作为辅助工具，这些靶点可被发展为高效的高通量筛选模型，并在短时间内随机筛选大量的活性化合物，发现活性更高的小分子化合物用于进一步的药物研发等应用。新的毒性筛选靶点或药物靶点或者对一个已知蛋白的功能做新的阐述，这对于分子水平阐明疾病的发生、发展和治疗尤其重要。

4、目前虽然基于微孔板作为实验工具载体的高通量筛查技术被广泛的应用于小分子化合物的筛选，但是基于细胞的fxr活性检测的双荧光素酶报告基因实验的筛选模型大多是以细胞为基础的，是通过细胞内荧光素酶的表达量间接反应配体与受体的结合作用，此外该方法需转染多个质粒，受体的活性受转染质粒比例的影响；在通量上该实验大多选用24孔板或96孔板；实验周期较长长，一般需要3-4天的时间；且该方法数据处理过程复杂，需计算萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性的比值，大大降低了检测灵敏度。

5、目前尚没有快速检测小分子化合物与fxr受体结合能力的方法。本发明首次构建了基于荧光偏振的小分子化合物与fxr受体结合能力的检测方法，可以有效筛选fxr的潜在配体。对于小分子化合物通过fxr通路介导的毒效应研究提供了技术支持。

技术实现思路

1、基于上述现有技术的需要，本发明的目的在于提供一种快速检测小分子化合物与fxr受体结合能力的方法。为实现上述发明目的，经研究，本发明提供如下技术方案：

2、本发明提供了一种快速检测小分子化合物与fxr受体结合能力的方法，包括以下步骤：

3、(1)将小分子荧光探针clf分散于第一溶剂并采用第二溶剂稀释形成探针clf溶液，然后将fxr受体分散于第二溶剂中形成fxr受体溶液，将所述探针clf溶液和fxr受体溶液进行混合孵育，形成第一混合体系，检测所述第一混合体系的荧光偏振信号；

4、(2)将待测的小分子化合物分散于第一溶剂并采用第二溶剂稀释形成小分子化合物溶液，再与荧光偏振值接近或达到最大值的第一混合体系进行混合孵育，形成第二混合体系，检测所述第二混合体系的荧光偏振信号；

5、(3)通过检测步骤(1)和步骤(2)的荧光偏振信号的变化，即可计算得出小分子化合物与fxr受体的直接结合能力。

6、任选地，所述小分子化合物包括全氟类化合物、双酚类化合物、有机磷阻燃剂类。

7、任选地，所述第一溶剂包括dmso。

8、任选地，所述第二溶剂包括tris缓冲液、pbs缓冲液。

9、优选地，步骤(1)中，所述混合孵育包括以下步骤：将小分子荧光探针clf分散于第一溶剂并采用第二溶剂稀释形成浓度为10-40nm的探针clf溶液，然后将fxr受体分散于5-100μl第二溶剂中形成浓度为20～800nm的fxr受体溶液，将所述探针clf溶液和fxr受体溶液进行混合，室温孵育1-50min。

10、进一步优选地，步骤(1)中，所述混合孵育包括以下步骤：将小分子荧光探针clf分散于dmso形成10mm探针clf溶液并采用tris缓冲液稀释形成浓度为20nm的探针clf溶液，然后将fxr受体分散于tris缓冲液中形成浓度为20～800nm的fxr受体溶液，将所述探针clf溶液和fxr受体溶液加入20μltris缓冲液进行共同混合，室温孵育5min，所述tris缓冲液中包含20mm tris-hcl，100mm nacl，ph 7.4。

11、优选地，步骤(2)中，所述混合孵育包括以下步骤：将待测的小分子化合物分散于5-200μl第一溶剂并采用第二溶剂稀释形成浓度为1nm-1mm的小分子化合物溶液，再与荧光偏振值接近或达到最大值的第一混合体系进行混合，室温孵育1-50min。

12、进一步优选地，步骤(2)中，所述混合孵育包括以下步骤：将待测的小分子化合物分散于5-200μldmso并采用tris缓冲液稀释形成浓度为1nm-1mm的小分子化合物溶液，再与荧光偏振值接近或达到最大值的第一混合体系加入100μltris缓冲液进行共同混合，室温孵育30min，形成第二混合体系，所述tris缓冲液中包含20mm tris-hcl，100mm nacl，ph7.4，维持在所述第二混合体系中dmso终浓度低于1％。

13、优选地，当所述fxr受体为人源fxr受体时，荧光偏振值接近或达到最大值的fxr受体浓度为400nm。

14、优选地，步骤(3)中，小分子化合物与fxr受体的直接结合能力根据配体的解离常数(kdligand)公式1计算得到：

15、ic50,ligand/[clf]total＝kdligand/kdclf           (公式1)

16、其中，[clf]total为体系探针clf的总浓度，kdclf为探针clf与受体相互作用的解离常数。

17、本发明的有益效果为：本发明基于小分子荧光探针检测小分子化合物与fxr受体直接结合的方法简单、快速、高通量，能准确的定量分析小分子化合物与fxr受体的结合作用。本发明的方法可以实现fxr受体和小分子化合物结合能力的定量分析，为后续的新污染物筛查和靶向药物设计提供基础。

18、本发明基于荧光偏振检测小分子化合物的方法，实验体系简单，仅需将fxr的配体结合域、荧光探针clf和小分子化合物直接混合孵育即可；可以使用384孔板，能够检测一种或多种小分子化合物，通量高；实验周期短，快速检测，仅需2-3个小时即可；数据处理方法简单，大大提高了检测灵敏度。

19、应当注意，本发明建立的筛选小分子化合物的方法具有非常好的可行性，应用范围广阔，不限于全氟类化合物、双酚类化合物、有机磷阻燃剂类，也可以是其他的小分子化合物，本发明的方法用于筛选新的化合物。

20、本发明的特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

技术特征：

1.一种快速检测小分子化合物与fxr受体结合能力的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的快速检测小分子化合物与fxr受体结合能力的方法，其特征在于，所述小分子化合物包括全氟类化合物、双酚类化合物、有机磷阻燃剂类。

3.如权利要求1所述的快速检测小分子化合物与fxr受体结合能力的方法，其特征在于，所述第一溶剂包括dmso。

4.如权利要求1所述的快速检测小分子化合物与fxr受体结合能力的方法，其特征在于，所述第二溶剂包括tris缓冲液、pbs缓冲液。

5.如权利要求1所述的快速检测小分子化合物与fxr受体结合能力的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述混合孵育包括以下步骤：将小分子荧光探针clf分散于第一溶剂并采用第二溶剂稀释形成浓度为10-40nm的探针clf溶液，然后将fxr受体分散于5-100μl第二溶剂中形成浓度为20～800nm的fxr受体溶液，将所述探针clf溶液和fxr受体溶液进行混合，室温孵育1-50min。

6.如权利要求5所述的快速检测小分子化合物与fxr受体结合能力的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述混合孵育包括以下步骤：将待测的小分子化合物分散于5-200μl第一溶剂并采用第二溶剂稀释形成浓度为1nm-1mm的小分子化合物溶液，再与荧光偏振值接近或达到最大值的第一混合体系进行混合，室温孵育1-50min。

7.如权利要求5所述的快速检测小分子化合物与fxr受体结合能力的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述混合孵育包括以下步骤：将小分子荧光探针clf分散于dmso形成10mm探针clf溶液并采用tris缓冲液稀释形成浓度为20nm的探针clf溶液，然后将fxr受体分散于tris缓冲液中形成浓度为20～800nm的fxr受体溶液，将所述探针clf溶液和fxr受体溶液加入20μltris缓冲液进行共同混合，室温孵育5min，所述tris缓冲液中包含20mm tris-hcl，100mm nacl，ph 7.4。

8.如权利要求6所述的快速检测小分子化合物与fxr受体结合能力的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述混合孵育包括以下步骤：将待测的小分子化合物分散于5-200μldmso并采用tris缓冲液稀释形成浓度为1nm-1mm的小分子化合物溶液，再与荧光偏振值接近或达到最大值的第一混合体系加入100μltris缓冲液进行共同混合，室温孵育30min，形成第二混合体系，所述tris缓冲液中包含20mm tris-hcl，100mm nacl，ph 7.4，维持在所述第二混合体系中dmso终浓度低于1％。

9.如权利要求1所述的快速检测小分子化合物与fxr受体结合能力的方法，其特征在于，当所述fxr受体为人源fxr受体时，荧光偏振值接近或达到最大值的fxr受体浓度为400nm。

10.如权利要求1所述的快速检测小分子化合物与fxr受体结合能力的方法，其特征在于，步骤(3)中，小分子化合物与fxr受体的直接结合能力根据配体的解离常数(kdligand)公式1计算得到：

技术总结
本发明公开了一种快速检测小分子化合物与FXR受体结合能力的方法，包括：(1)将小分子荧光探针CLF分散于第一溶剂并采用第二溶剂稀释形成探针CLF溶液，然后将FXR受体分散于第二溶剂中形成FXR受体溶液，混合孵育，形成第一混合体系，检测所述第一混合体系的荧光偏振信号；(2)将待测的小分子化合物分散于第一溶剂并采用第二溶剂稀释形成小分子化合物溶液，再与第一混合体系进行混合孵育，形成第二混合体系，检测所述第二混合体系的荧光偏振信号；(3)通过检测步骤(1)和步骤(2)的荧光偏振信号的变化即可计算得出小分子化合物与FXR受体的直接结合能力。本发明的方法简单、快速、高通量，能准确的定量分析小分子化合物与FXR受体的结合作用。

技术研发人员：李传海,张东辉,刘欣雅,于典科
受保护的技术使用者：青岛大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12