一种细胞培养液中能量物质的检测方法及其应用与流程

本发明属于生物材料检测领域，具体涉及一种细胞培养液中能量物质的检测方法及其应用，尤其涉及一种准确度高的细胞培养液中能量物质的检测方法及其应用。

背景技术：

1、特定细胞如胚胎细胞发育营养早期，主要使用丙酮酸和乳酸作为主要能量来源。丙酮酸的缺失会使到达8细胞期甚至到达8细胞期之前受到发育阻滞，同时还参与细胞的抗氧化应激；乳酸作为能量物质则与丙酮酸有着协同作用，主要影响着细胞活力。因此在细胞体外培养过程中，所使用的各类细胞培养液作为细胞生存的直接接触环境，一般都会添加丙酮酸和/或乳酸的代替物丙酮酸钠和/或乳酸钠作为能量供给来源。不直接使用丙酮酸和/或乳酸作为能量来源的原因有两点：1、丙酮酸和乳酸都呈酸性，若作为配制组分很容易使培养液的ph严重降低进而很难实现物料平衡；2、乳酸很容易先于其他营养组分进入细胞膜，降低细胞内的ph进而对活力造成消极影响。

2、现有技术提供的细胞培养液多作为商品化试剂，按相应法规的要求在其出厂前需要对该细胞培养液的主要组分包括丙酮酸钠和/或乳酸钠进行含量测定，以保证其实际使用过程的安全性和有效性。

3、现有技术中常规采用化学法进行丙酮酸钠和/或乳酸钠的检测分析，但由于细胞培养液中往往还含有各类氨基酸和糖类物质形成的干扰物质，导致检测结果精确度不高。此外，检测结果还容易受到人主观因素如不同的操作人员或操作人员对操作规范的理解不同的影响，导致检测结果出现误差，甚至错误，进而造成检测数据不可用或资源浪费等后果。因此，如何提供一种准确度高的丙酮酸钠和/或乳酸钠的检测分析方法，成为了亟待解决的问题。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种细胞培养液中能量物质的检测方法及其应用，尤其提供一种准确度高的细胞培养液中能量物质的检测方法及其应用。本发明提供的检测方法精密度高、准确性高，能够有效对细胞培养液中的丙酮酸钠、乳酸钠进行准确地定量。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、一方面，本发明提供了一种细胞培养液中能量物质的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：

4、(1)将待测样品用滤膜过滤，得到供试品溶液；

5、(2)将供试品溶液进行液相检测，根据检测结果结合标准曲线计算待测样品中能量物质的含量；

6、步骤(2)所述液相检测的流动相为酸溶液和有机溶剂的混合液。

7、所述有机溶剂包括异丙醇、乙腈或乙醇中任意一种或至少两种的组合，例如异丙醇和乙腈的组合、乙腈和乙醇的组合或异丙醇和乙醇的组合等，但不限于以上所列举的组合，上述组合范围内其他未列举的组合同样适用。

8、所述能量物质包括乳酸钠和/或丙酮酸钠。

9、上述方法通过采用液相的方式，能够有效避免酶法和化学法中受到细胞培养液中其他物质影响的问题，具有更高的检测准确性；此外，本申请还通过选择特定的流动相，并向其中加入特定的有机溶剂能够有效提高检测的准确度，减少误差。

10、优选地，所述酸溶液为硫酸溶液、盐酸溶液或磷酸溶液中任意一种或至少两种的组合，例如硫酸溶液和盐酸溶液的组合、盐酸溶液和磷酸溶液的组合或磷酸溶液和硫酸溶液的组合等，但不限于以上所列举的组合，上述组合范围内其他未列举的组合同样适用，优选硫酸溶液。

11、上述特定酸溶液能够有效将乳酸钠和丙酮酸钠加以置换，再经特定色谱柱能够有效乳酸钠和丙酮酸钠进行有效分离、检测，提高检测准确度；同时优选的酸溶液能够进一步提高检测的准确度。

12、优选地，所述酸溶液的浓度为4-6mm，例如4mm、4.5mm、5mm、5.5mm或6mm等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。

13、优选地，所述有机溶剂为乙腈和异丙醇的组合。

14、上述特定溶剂组合通过将异丙醇、乙腈复配，并结合特定的色谱条件能够有效提高检测的准确度

15、优选地，所述有机溶剂在酸溶液中的体积分数为2-5％，例如2％、3％、4％或5％等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。

16、优选地，所述色谱柱的固定相包括磺化聚苯乙烯二乙烯苯树脂或磺化苯乙烯-二乙烯基苯树脂，优选磺化聚苯乙烯二乙烯苯树脂。

17、上述特定固定相选择能够有效将细胞培养液中的乳酸钠和丙酮酸钠进行分离，同时减少其它成分的影响，提高检测准确度。

18、优选地，所述液相检测的柱温为30-42℃。

19、优选地，所述液相检测的洗脱方式为等度洗脱；

20、优选地，所述液相检测中，流动相的流速为0.4-1ml/min。

21、优选地，所述液相检测的检测波长为210-320nm。

22、其中，柱温可以是30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃或42℃等，流速可以是0.4ml/min、0.5ml/min、0.6ml/min、0.7ml/min、0.8ml/min、0.9ml/min或1ml/min等，检测波长可以是210nm、220nm、230nm、240nm、250nm、260nm、270nm、280nm、290nm、300nm、310nm或320nm等，但不限于以上所列举的数值，上述数值范围内其他未列举的数值同样适用。

23、另一方面，本发明还提供了如上所述的检测方法在细胞培养液质量控制中的应用。

24、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

25、本发明提供了一种细胞培养液中能量物质的检测方法，通过采用液相的方式，能够有效避免酶法和化学法中受到细胞培养液中其他物质影响的问题，具有更高的检测准确性；此外，本申请还通过选择特定的流动相，并向其中加入特定的有机溶剂能够有效提高检测的准确度，减少误差。

技术特征：

1.一种细胞培养液中能量物质的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述酸溶液为硫酸溶液、盐酸溶液或磷酸溶液中任意一种或至少两种的组合，优选硫酸溶液。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述酸溶液的浓度为4-6mm。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙腈和异丙醇的组合。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述有机溶剂在酸溶液中的体积分数为4-10％。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述色谱柱的固定相包括磺化聚苯乙烯二乙烯苯树脂或磺化苯乙烯-二乙烯基苯树脂，优选磺化聚苯乙烯二乙烯苯树脂。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述液相检测的柱温为30-42℃。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述液相检测的洗脱方式为等度洗脱；

9.根据权利要求1-8中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述液相检测的检测波长为210-320nm。

10.一种根据权利要求1-9中任一项所述的检测方法在细胞培养液质量控制中的应用。

技术总结
本发明提供了一种细胞培养液中能量物质的检测方法及其应用，所述检测方法包括以下步骤：(1)将待测样品用滤膜过滤，得到供试品溶液；(2)将供试品溶液进行液相检测，根据检测结果结合标准曲线计算待测样品中能量物质的含量；步骤(2)所述液相检测的流动相为酸溶液和有机溶剂的混合液；所述有机溶剂包括异丙醇、乙腈或乙醇中任意一种或至少两种的组合；所述能量物质包括乳酸钠和/或丙酮酸钠。本发明提供的检测方法精密度高、准确性高，能够有效对细胞培养液中的丙酮酸钠、乳酸钠进行准确地定量。

技术研发人员：王书晗,刘文亮,徐海燕,彭俊,高小凤,马森菊,张彩梅,周汨,柯浩奇,赖宇堃
受保护的技术使用者：深圳市药品检验研究院（深圳市医疗器械检测中心）
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12