一种级联信号放大的癌胚抗原定量检测试剂盒及检测方法

本发明涉及生物检测，具体为一种级联信号放大的癌胚抗原定量检测试剂盒及检测方法。

背景技术：

1、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，cea)是一种广谱肿瘤标志物，作为一种分子量为200kda的糖蛋白，与结直肠癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌和甲状腺髓样癌直接相关。健康成人中cea的正常水平约为3.0–5.0ng/ml，高水平的cea可预示癌症的存在。因此，开发一种灵敏、简便的cea检测方法具有重要的临床意义。目前，针对cea的检测方法主要有、酶联免疫吸附测定、荧光免疫测定、化学发光免疫测定等，存在操作繁琐、仪器设备要求高、发光时间短、检测样本受限等缺点，难以满足快速定性检测及早期筛查要求。

2、针对传统检测方法的局限性和新兴检测方法的有限，利用dna纳米机器的动态机械能及cripsr cas12a的核酸剪刀、级联放大信号功能，开发简便、快速的cea检测试剂盒，通过有无荧光信号定性判读血清样品中cea含量，筛查高水平cea含量人群，实现肿瘤的早期筛查的目的，本发明提出了一种级联信号放大的癌胚抗原定量检测试剂盒及检测方法。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种级联信号放大的癌胚抗原定量检测试剂盒及检测方法，解决了目前操作繁琐、仪器设备要求高、发光时间短、检测样本受限等缺点，难以满足快速定性检测及早期筛查要求的问题。

2、为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种级联信号放大的癌胚抗原定量检测试剂盒，包括dna纳米机器溶液n1～n2、锰离子溶液m、crispr cas12a溶液c1～c4和标准溶液。

3、本发明还提供一种级联信号放大的癌胚抗原定量检测方法，包括以下步骤：

4、s1、制备dna纳米机器溶液n1；

5、s2、制备dna纳米机器溶液n2；

6、s3、制备锰离子溶液m与crispr cas12a溶液c1～c4；

7、s4、cea检测：

8、1)、取待测溶液与dna纳米机器溶液n1、dna纳米机器溶液n2，37℃孵育15min后加入锰离子溶液m；

9、2)、37℃孵育60min后磁分离，收集上清液，加入c1、c2、c3、c4，继续37℃孵育5min；

10、3)、于手提紫外下观测荧光并于荧光分光光度计测量荧光光谱。

11、进一步的，s1中n1的具体制备方法如下：

12、1)、取500μl氯金酸(1％，w/v)与52ml去离子水剧烈搅拌并加热至沸腾，迅速加入1％的2ml柠檬锰酸三钠混合液(含0.05％柠檬酸，w/v)，继续加热剧烈搅拌5min使溶液颜色变为酒红色，冷却至室温后得到金纳米粒子，4℃保存备用；

13、2)、取15μl walker dna(10μm)序列与15μl适配体dna(30μm)序列、20μl pbs(10mm)缓冲液混合，95℃加热5分钟，4℃冷却5分钟，室温条件下孵育60min后，加入1ml制备的金纳米粒子溶液中，混匀过夜后，加入浓度5m的nacl老化并放置24h，12000rpm离心20min去除未结合的dna序列，重悬于浓度为10mm的pbs溶液中，制备得到dna纳米机器溶液n1。

14、进一步的，s2中n2的具体制备方法如下：

15、1)、取1.62g氯化铁溶于60ml乙二醇，室温下剧烈搅拌至完全溶解后加入2.7g醋酸钠和0.1839g sds，继续室温剧烈搅拌至完全溶解，随后转移到反应釜中200℃反应12h，冷却至室温后，沉淀物于乙醇和去离子水中交替冲洗3次，于真空干燥箱中烘干，得到dna纳米机器溶液n2的磁性核心fe3o4纳米粒子；

16、2、)取10mg fe3o4，用甲醇冲洗三次，加入2ml pei-koh-cs2溶液，混匀后静置1h，冲洗后分散于4ml去离子水中，再加入30ml金种子溶液，室温下剧烈搅拌1h，得到dna纳米机器溶液n2的复合纳米材料；

17、3)、将1mg/ml的fe3o4@au与10μl track dna(100μm)混合后室温孵育过夜，磁分离去除未结合dna序列，重悬于浓度为10mm的pbs溶液中，制备得到dna纳米机器溶液n2。

18、进一步的，s3中锰离子溶液m制备方法为：称取mnci2·4h2o 1.98g加入1l depc处理水，制备为10mm锰离子溶液m。

19、进一步的，s4中具体检测计量如下：待测溶液100μl、dna纳米机器溶液n1 5μl、dna纳米机器溶液n2 25μl、锰离子溶液m 20μl、c1 3μl，c22μl、c3 4μl、c4 1μl。

20、进一步的，crispr cas12a溶液c1～c4分别为：c1为50nm cas12a蛋白酶、c2为50nmcrrna序列、c3为酶切缓冲液，c4为20μm报告探针溶液。

21、有益效果

22、本发明提供了一种级联信号放大的癌胚抗原定量检测试剂盒及检测方法。与现有技术相比具备以下有益效果：

23、本发明在制备dna纳米机器溶液后，将待测样品与dna纳米机器溶液孵育，通过磁分离获取上清液进行cripsr cas12a信号扩增反应，实现癌胚抗原的定性检测；利用本发明制备的试剂盒进行癌胚抗原检测，可使癌胚抗原含量大于5ng/ml的样品呈现荧光，从而快速甄别正常癌胚抗原水平人群和高癌胚抗原水平人群，实现肿瘤的早期筛查。

技术特征：

1.一种级联信号放大的癌胚抗原定量检测试剂盒，其特征在于：包括dna纳米机器溶液n1～n2、锰离子溶液m、crispr cas12a溶液c1～c4和标准溶液。

2.一种级联信号放大的癌胚抗原定量检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的一种级联信号放大的癌胚抗原定量检测方法，其特征在于：s1中n1的具体制备方法如下：

4.根据权利要求2所述的一种级联信号放大的癌胚抗原定量检测方法，其特征在于：s2中n2的具体制备方法如下：

5.根据权利要求2所述的一种级联信号放大的癌胚抗原定量检测方法，其特征在于：s3中锰离子溶液m制备方法为：称取mnci2·4h2o 1.98g加入1ldepc处理水，制备为10mm锰离子溶液m。

6.根据权利要求2所述的一种级联信号放大的癌胚抗原定量检测方法，其特征在于：s4中具体检测计量如下：待测溶液100μl、dna纳米机器溶液n15μl、dna纳米机器溶液n2 25μl、锰离子溶液m 20μl、c1 3μl，c2 2μl、c3 4μl、c4 1μl。

7.根据权利要求2所述的一种级联信号放大的癌胚抗原定量检测方法，其特征在于：crispr cas12a溶液c1～c4分别为：c1为50nm cas12a蛋白酶、c2为50nm crrna序列、c3为酶切缓冲液，c4为20μm报告探针溶液。

技术总结
本发明公开了一种级联信号放大的癌胚抗原定量检测试剂盒，包括DNA纳米机器溶液N1～N2、锰离子溶液M、CRISPR Cas12a溶液C1～C4和标准溶液。本发明在制备DNA纳米机器溶液后，将待测样品与DNA纳米机器溶液孵育，通过磁分离获取上清液进行CRIPSR Cas12a信号扩增反应，实现癌胚抗原的定性检测，解决了目前操作繁琐、仪器设备要求高、发光时间短、检测样本受限等缺点，难以满足快速定性检测及早期筛查要求的问题。

技术研发人员：王娟,姚硕,赵超
受保护的技术使用者：吉林大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13