一种特异性检测恩诺沙星的方法

本发明涉及恩诺沙星检测领域，具体涉及一种特异性检测恩诺沙星的方法。

背景技术：

1、氟喹诺酮类抗生素是第三代喹诺酮类抗生素，即氟喹诺酮类抗生素(fluoroquinolones，fqs)。因其高效、低毒等特点被广泛应用于畜牧和水产养殖行业中。恩诺沙星(enrofloxacin，enr)作为第一个动物专用的喹诺酮类药物，主要对革兰氏阴性菌有杀灭作用。恩诺沙星常见于土壤、地下水、地表水和畜禽废水中，在泰国、越南、中国等地方的水产品中都检测出enr，尽管在水环境中检出浓度都很低，但因其在水中较难降解，对微生物、植物和动物有一定的毒性和危害。进入食物链后影响人类健康，长期接触具有致癌、致畸、致突变的风险。

2、由于aunps独特的局域表面等离子体共振特性，常被用于生物传感器和生物成像。因表面体积比和良好的生物相容性，常被用于生物靶点的特异性结合和检测。其优点不仅具有灵敏高、操作简单、信号响应速度快、检测结果直观、不需要额外的辅助设备等，而且适用于现场检测和实验条件较差的落后区域。

3、裂开型适配体(split aptamer，spa)是将优化过后的适配体拆分成两个或者三个片段，这些片段在一起作用时易形成三明治结构，使传感器具有较高的灵敏度。spa因其所需碱基较少，有利于生物合成，所需成本较低；并且结构简单，有利于避免不良的二级结构的产生，与目标物的特异性结合，具有较高的特异性。

4、当今，国内外检测fqs的方法包括高效液相色谱法、超高效液相色谱-串联质谱法、酶联免疫法、分子印迹聚合物法等，但是这些方法前处理时间长、检测过程复杂、不能满足大批量检测的需求、对操作人员有较高的要求等特点。因此，许多国规定了enr的最高残留量。我国及欧盟等国分别规定了最大残留量(mrls)，且规定了动物源性食品(包括牛/羊奶及水产品等)中enr的mrls为100μg/kg(约0.28μm)。因此，基于enr抗生素对人体健康的危害以及对生态环境的影响，开发一种灵敏度高、特异性强、操作简单的检测方法对检测enr抗生素具有重要意义。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种特异性检测恩诺沙星的方法，基于裂开型适配体和金纳米颗粒的比色生物传感器检测恩诺沙星，具有简单、快速、高灵敏、高特异性等优势。

2、为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

3、一种特异性检测恩诺沙星的方法：将裂开型适配体spa、aunps、待测样品依次加入到tris-hcl缓冲液中，形成反应体系溶液，在反应体系溶液中加入包含haucl4和nh2oh·hcl的增敏剂溶液，根据反应体系里的aunps的颜色变化，定性检测待测样品是否含有恩诺沙星。

4、所述的特异性检测恩诺沙星的方法：将裂开型适配体spa、aunps、待测样品依次加入到tris-hcl缓冲液中，形成反应体系溶液，在反应体系溶液中加入包含haucl4和nh2oh.hcl的增敏剂溶液，建立吸光度比率(a-a0)/a0与enr浓度之间的标准曲线，利用绘制的标准曲线测得待测样品中enr的浓度。

5、所述的特异性检测恩诺沙星的方法，spa与tris-hcl缓冲液的浓度比为1：200。

6、所述的特异性检测恩诺沙星的方法，aunps在520nm处的吸光度值为0.5且aunps的体积占反应体系溶液体积的1/2。

7、所述的特异性检测恩诺沙星的方法，a＝a670/a540。

8、所述的裂开型适配体spa由两段核苷酸序列组成，其中一段核苷酸序列为：5’-cccatcagggggctaggctaacacggttcggc-3’；另一段核苷酸序列为：5’-tctctgagcccgggttatttcaggggga-3’。

9、所述的特异性检测恩诺沙星的方法，通过裂开型适配体spa中的碱基与aunps表面的负电荷发生静电作用而附着在aunps的表面，形成aunps/spa复合体。

10、进一步的，aunps的制备方法为：取0.2mm的haucl4溶液，加热至沸腾，沸腾后加入1wt.％柠檬酸三钠溶液，继续加热至溶液变为酒红色时再加热10分钟后停止加热，溶液自然冷却至室温后停止搅拌并用0.45μm的微孔过滤器进行过滤，得到的aunps。

11、本申请中，是采用haucl4溶液与柠檬酸三钠溶液的体积比为100：7进行制备aunps的。

12、进一步的，spa与tris-hcl缓冲液的浓度比为1：200。

13、进一步的，本申请中spa浓度为100nm；tris-hcl缓冲溶液中含1mm mg2+和1mm k+；tris-hcl缓冲溶液的浓度为20mm，ph＝7.4。

14、进一步的，aunps在520nm处的吸光度值为0.5且aunps的体积占反应体系溶液体积的1/2。

15、进一步的，enr的检测范围为0-100μm，检出限低于0.01μm，线性检测范围为0.01-0.2μm，线性回归方程为y＝1.385x+0.03295。

16、相比于现有技术，本发明的有益效果为：

17、(1)本发明应用了易于合成，成本低廉，易形成三明治结构的spa，使其具有较高的特异性和选择性，结果更可靠。

18、(2)本发明为了避免金纳米颗粒被tris-hcl缓冲液聚集，将spa包裹在金纳米颗粒的表面，由于目标物和spa的特异性结合，使得金纳米颗粒被tris-hcl缓冲液和增强剂双重作用而聚集，能够有效检测目标物。

19、(3)本发明方法操作简单，检测快速方便，不需要依赖大型的设备仪器，可以进行肉眼进行观察，对检测环境和时间要求不严格。

20、(4)本发明方法可用于高灵敏检测牛奶、水样中的enr。

技术特征：

1.一种特异性检测恩诺沙星(enr)的方法，其特征在于：将裂开型适配体spa、aunps、待测样品依次加入到tris-hcl缓冲液中，形成反应体系溶液，在反应体系溶液中加入包含haucl4和nh2oh·hcl的增敏剂溶液，根据反应体系里的aunps的颜色变化，定性检测待测样品是否含有恩诺沙星。

2.根据权利要求1所述的特异性检测恩诺沙星的方法，其特征在于：将裂开型适配体spa、aunps、待测样品依次加入到tris-hcl缓冲液中，形成反应体系溶液，在反应体系溶液中加入包含haucl4和nh2oh·hcl的增敏剂溶液，建立吸光度比率(a-a0)/a0与enr浓度之间的标准曲线，利用绘制的标准曲线测得待测样品中enr的浓度。

3.根据权利要求1或2所述的特异性检测恩诺沙星的方法，其特征在于，spa与tris-hcl缓冲液的浓度比为1：200。

4.根据权利要求1或2所述的特异性检测恩诺沙星的方法，其特征在于，aunps在520nm处的吸光度值为0.5且aunps的体积占反应体系溶液体积的1/2。

5.根据权利要求1或2所述的特异性检测恩诺沙星的方法，其特征在于，a＝a670/a540。

6.根据权利要求1或2所述的特异性检测恩诺沙星的方法，其特征在于，所述的裂开型适配体spa由两段核苷酸序列组成，其中一段核苷酸序列为：5’-cccatcagggggctaggctaacacggttcggc-3’；另一段核苷酸序列为：5’-tctctgagcccgggttatttcaggggga-3’。

7.根据权利要求1或2所述的特异性检测恩诺沙星的方法，其特征在于，通过裂开型适配体spa中的碱基与aunps表面的负电荷发生静电作用而附着在aunps的表面，形成aunps/spa复合体。

8.根据权利要求1或2所述的特异性检测恩诺沙星的方法，其特征在于，spa浓度为100nm；tris-hcl缓冲溶液中含1mm mg2+和1mmk+；tris-hcl缓冲溶液的浓度为20mm，ph＝7.4。

9.根据权利要求1或2所述的特异性检测恩诺沙星的方法，其特征在于，aunps在520nm处的吸光度值为0.5且aunps的体积占反应体系溶液体积的1/2。

10.根据权利要求1或2所述的特异性检测恩诺沙星的方法，其特征在于，enr的检测范围为0-100μm，检出限低于0.01μm，线性检测范围为0.01-0.2μm，线性回归方程为y＝1.385x+0.03295。

技术总结
本发明公开了一种特异性检测恩诺沙星的方法，涉及恩诺沙星检测领域。该方法将SPA、AuNPs、待测样品依次加入到Tris‑HCl缓冲液中，然后加入增敏剂溶液，根据反应体系里的AuNPs的颜色和吸光度变化，实现定性和定量检测待测样品是否含有恩诺沙星。本发明应用了易于合成，成本低廉，易形成三明治结构的SPA，由于目标物和SPA的特异性结合，使得金纳米颗粒被Tris‑HCl缓冲液和增强剂双重作用而聚集，能够有效检测目标物，结果更可靠。且本发明方法操作简单，检测快速方便，不需要依赖大型的设备仪器，可以进行肉眼进行观察，对检测环境和时间要求不严格。

技术研发人员：李胎花,李滨汐,王安琪,蒋文萍,韩建刚,金龙,李威
受保护的技术使用者：南京林业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12